Pestisid yo jwe yon wòl enpòtan nan adrese pwoblèm mank manje mondyal la epi nan konbat maladi moun ki transmèt pa vektè. Sepandan, pwoblèm rezistans pestisid k ap grandi a mande ijan pou nou dekouvri nouvo konpoze ki vize sib ki pa byen itilize yo. Chanèl potansyèl reseptè tranzitwa ensèk yo (TRPV)—Nanzhong (Nan) ak inaktif (Iav)—ka fòme chanèl etewojèn (Nan-Iav) epi lokalize yo nan ògàn mekanosansoryèl ki medyatè jeyotropis, tande, ak propriyosepsyon nan ensèk yo. Gen kèk pestisid, tankou afidopirolidòn (AP), ki vize Nan-Iav atravè mekanis enkoni. AP efikas kont ensèk ki pike-souse (emiptè), li anpeche yo manje lè li deranje fonksyon filaman yo. AP ka sèlman mare ak Nan, men se sèlman Nan-Iav ki ka kominike avèk agonis, tankou nikotinamid andojèn (NAM), kidonk li montre aktivite chanèl. Malgre potansyèl Nan-Iav kòm yon sib ensektisid, nou pa konnen anpil bagay sou asanblaj chanèl li yo, sit lyezon regilatè li yo, ak règleman ki depann de Ca2+, sa ki anpeche plis devlopman ensektisid. Nan etid sa a, yo te itilize mikwoskopi kriyo-elektwon pou detèmine estrikti Nan-Iav nan ensèk Hemiptera nan eta san ligand kalmodulin, ansanm ak AP ak NAM nan limit domèn sitoplasmik repetisyon ankirin (ARD). Etonan, nou te jwenn ke pwoteyin Nan nan li menm ka fòme yon pentamè, ki estabilize pa entèraksyon ARD medyatè pa AP. Etid sa a revele entèraksyon molekilè ant ensektisid ak agonis ak Nan-Iav, mete aksan sou enpòtans ARD nan fonksyon ak asanblaj chanèl, epi eksplore mekanis règleman Ca2+ la.
Nan kontèks chanjman klimatik mondyal ki ap vin pi grav, deteryorasyon sekirite alimantè mondyal la se youn nan gwo defi 21yèm syèk la, ak konsekans kaskad pou sosyete a.1,2Rapò Òganizasyon Mondyal Lasante sou Eta Sekirite Alimentè ak Nitrisyon nan Mond lan an 2023 (SOFI) estime ke apeprè 2.33 milya moun atravè lemond soufri anba ensekirite alimantè modere pou rive grav, yon pwoblèm ki dire lontan.3,4Malerezman, yo estime ke 20% a 30% oswa plis nan rekòt yo pèdi chak ane akòz ensèk nuizib ak patojèn, epi yo prevwa rechofman planèt la pral agrave rezistans ensèk nuizib yo ak vilnerabilite rekòt yo.4,5,6,7,8Devlopman pestisid enpòtan non sèlman pou pwoteje rekòt yo kont ensèk nuizib epi redwi pwopagasyon patojèn ki transmèt pa vektè, men tou pou konbat maladi imen ki transmèt pa vektè tankou lafyèv deng, malarya ak maladi Chagas, ki vin pi rezistan a pestisid.5,9,10,11
Pami prensipal sib ensektisid newotoksik yo, kanal TRPV eterotetramerik Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) la reprezante yon klas sib ensektisid yo te dekouvri sèlman nan dènye deseni a, ki gen ladan ensektisid ki disponib nan komès tankou imidacloprid ak pyraclostrobin.12, 13, 14Ensektisid semi-sentetik aphidopyrrolifen (AP) la se yon pwodui ki fèk devlope epi komèsyalize ki gen prensipal eleman li se ensektisid aktif Inscalis® la, ki mare AP nan yon nivo aktivite subnanomolè.15AP montre yon toksisite egi ki ba pou polinizatè, ensèk benefik, ak lòt òganis ki pa sib, epi lè yo itilize li dapre enstriksyon ki sou etikèt la, li ka diminye presyon rezistans a lòt ensektisid.16, 17, 18Nan ak Iav yo lajman distribye nan tout espès ensèk yo, yo ko-eksprime sèlman nan newòn reseptè detire kòd antèn yo ak manm yo, epi yo esansyèl pou tande, pèsepsyon gravite, ak propriyosepsyon.13,16,19,20,21,22AP, imidacloprid, ak pyraclostrobin estimile konplèks Nan-Iav la atravè yon mekanis inik, sa ki finalman anpeche transdiksyon siyal proprioseptif la.13,16,23Nan ensèk ki pike epi souse (emipteran) tankou afid ak mouch blan, pèt propriyosepsyon afekte kapasite yo pou manje, sa ki finalman mennen nan lanmò.13,24Sa ki enteresan, AP montre yon gwo afinite pou konplèks Nan-Iav la epi yon ti afinite pou Nan sèlman. Lè AP mare ak Nan-Iav, sa pwovoke yon kouran elektrik, men lè Iav sèlman mare ak Nan, sa pa estimile aktivite kanal la. Iav li menm pa mare ak AP ditou.16Sa sijere ke Nan ak Iav ka mare pou fòme diferan konplèks kanal Nan-Iav (pa egzanp, ak diferan rapò stokiyometrik oswa diferan aranjman nan menm rapò stokiyometrik la) oswa ke AP ka mare ak plizyè sit. Anplis de sa, nikotinamid agonist natirèl la (NAM) mare ak Drosophila Nan-Iav ak afinite mikromolè, ki montre efè menm jan ak sa yo ki nan afid (AP) in vitro.16,25epi anpeche repwodiksyon ak manje afid yo, sa ki finalman mennen nan lanmò yo25,26Done sa yo soulve anpil kesyon. Pa egzanp, li rete enkoni kijan eterodimè Nan-Iav la fòme, ki sit lyezon yo itilize pou modifye ti molekil yo, ak kijan ti molekil sa yo kontwole fonksyon kanal la lè yo siprime propriyosepsyon. Anplis de sa, rezon ki fè Nan li menm inaktif epi li gen yon afinite ki ba pou AP, alòske eterodimè Nan-Iav la aktif epi li mare AP ak yon afinite ki pi wo, rete enkoni. Finalman, nou pa konnen anpil bagay sou règleman fonksyon Nan-Iav ki depann de Ca2+ ak kijan li entegre nan pwosesis siyalizasyon newòn yo.13,21
Nan etid sa a, nou konbine mikwoskopi kriyo-elektwon, elektwofizyoloji, ak teknik lyezon radyoligand, nou te klarifye asanblaj Nan-Iav ak mekanis lyezon li ak regilatè ti molekil yo. Anplis de sa, nou detekte kalmodulin (CaM) lye konstitifman ak Iav ak pentamè Nan estabilize ak AP. Rezilta sa yo bay enfòmasyon enpòtan sou règleman iyon kalsyòm nan chanèl yo, asanblaj chanèl yo, ak faktè ki detèmine afinite lyezon ligand yo. Pi enpòtan toujou, nou konfime ke ARD jwe yon wòl santral nan pwosesis sa yo. Etid nou an sou chanèl ensèk konplè ki lye ak pestisid agrikòl ki enpòtan yo27, 28, 29Sa ouvè pèspektiv pou devlopman endistri pestisid la, amelyore efikasite ak espesifikite pestisid yo, epi pèmèt aplikasyon konpoze ki vize TRPV sou lòt espès pou adrese sekirite alimantè mondyal la ak pwopagasyon maladi vektè yo.
Nou te jwenn tou ke Nan-Iav reglemante pa Ca2+, epi mekanis regilasyon an medyatè pa CaM ki lye konstitivman. Sa ki enpòtan, regilasyon Nav ki depann de Ca2+ pa CaM diferan anpil de mekanis regilasyon lòt chanèl iyon yo (pa egzanp, chanèl Na+ ki depann de vòltaj ak chanèl TRPV5/6).52,53,54,55,56,57Nan kanal Nav1.2 la, domèn C-tèminal CaM lan asosye elikoidman ak domèn C-tèminal la (CTD), epi Ca2+ pwovoke lyezon domèn N-tèminal li a ak pòsyon distal CTD a.56Nan kanal TRPV5/6 la, domèn C-tèminal CaM lan mare ak CTH, epi Ca2+ pwovoke yon ekstansyon anlè nan domèn N-tèminal li a nan pò a, kidonk bloke pèmeyabilite kasyon an.53,54Nou pwopoze yon modèl pou fonksyon Nan-Iav-CaM ki reglemante pa Ca2+ (Fig. 4h). Nan modèl sa a, domèn N-tèminal CaM lan mare konstitivman ak domèn C-tèminal (CTH) Iav la. Nan eta repo a (konsantrasyon [Ca2+] ki ba), domèn C-tèminal CaM lan kominike avèk Nan, sa ki estabilize konfòmasyon ARD la epi kidonk ankouraje ouvèti kanal la. Lè yon agonist/ensèktisid mare ak kanal la, sa ki lakòz yon afli Ca2+. Apre sa, Ca2+ mare ak CaM, sa ki lakòz disosyasyon domèn C-tèminal la ak ARD Nan la. Piske bloke lyezon CaM a esansyèlman aboli efè inibitwa Ca2+ la, disosyasyon sa a module mobilite ARD la, kidonk sa ki lakòz yon inibisyon oswa desensibilizasyon ki depann de Ca2+. Rekiperasyon rapid kouran kanal yo apre elisyon iyon kalsyòm lan (Fig. 4g) sijere ke mekanis sa a fasilite repons rapid a siyal newòn ki medyatè pa Ca2+. Anplis, yo rapòte ke rejyon C-tèminal Iav la, ki toujou pa byen konprann, jwe lòt wòl nan siblaj chanèl ak règleman aktyèl.21
Finalman, etid nou an prezante estrikti wo rezolisyon yon konplèks kanal TRP ensektisid-ensektisid ki gen enpòtans agrikòl—yon dekouvèt nou pa t konnen anvan. Li enpòtan pou note ke nou te karakterize estrikti ak fonksyon kanal ensèk la nan selil imen (HEK293S GnTi–) olye ke nan selil ensèk. Fas a rezistans k ap grandi nan ensèktisid ak presyon kontinyèl sou sekirite alimantè ak patojèn yo, travay nou an bay enfòmasyon enpòtan ki pral fasilite devlopman nouvo ensèktisid pou benefis sante moun ak sekirite alimantè mondyal. Etid yo montre ke ensèktisid tankou AP efikas kont kèk ensèk nuizib lè yo itilize yo dapre enstriksyon ki sou etikèt la epi yo gen yon toksisite egi ki ba pou polinizatè benefik yo, sa ki demontre sekirite anviwònman yo.13,16Anplis, tès kèk dérivés AP sou moustik yo montre ke yo pèdi kapasite yo pou vole evantyèlman. Konprann kijan konpoze modulation sa yo lye ak Nan-Iav pral fasilite modifikasyon konpoze ki deja egziste yo oswa devlopman nouvo konpoze pou pi efikas akpresikontwòl ensèk nuizib. Etid nou an demontre ke koòdone Nan-Iav ARD la enpòtan non sèlman pou reglemante aktivite konpoze andojèn, pestisid, ak Ca2+-CaM, men tou pou asanblaj chanèl yo. Nou sijere ke deranje asanblaj eterodimè ak ti molekil yo kapab yon apwòch inik ak pwomèt pou devlope inibitè chanèl iyon yo.
Nan uit jèn ortològ yo, yo te chwazi jèn konplè eskarabe mawon (Halyomorpha halys) Nanchung ak Inactive, ki montre yon ekselan estabilite nan detèjan. Yo te optimize kodon jèn sentetize yo pou ekspresyon imen epi yo te klone yo nan vektè pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) lè l sèvi avèk sit restriksyon XhoI ak EcoRI. Sa te asire ke klon yo te nan kad ak etikèt C-tèminal GFP-FLAG-10xHis ak mCherry-FLAG-10xHis yo, ki fann pa pwoteaz HRC-3C (PPX), sa ki pèmèt endepandans...ekspresyonYo te itilize amorseur pou klone Nanchung ak Inactive nan vektè pBacMam nan jan sa a:
Yo te pran imaj mikwoskopik patikil endividyèl yo sou yon mikwoskòp elektwonik transmisyon (FEI) Titan Krios G2 ekipe ak yon kamera K3 ak yon filtè enèji Gatan BioQuantum. Yo te opere mikwoskòp la a 300 keV, ak yon paramèt enèji 20 eV, yon gwosè pixel echantiyon 1.08 Å/pixel (agrandisman nominal 81,000x), ak yon gradyan defokalizasyon ki varye ant -0.8 ak -2.2 μm. Yo te fè anrejistreman videyo a 40 imaj pa segonn lè l sèvi avèk yon mikwoskòp Latitude S (Gatan) ak yon to dòz nominal 25 e–px−1 s−1, yon tan ekspozisyon 2.4 s, ak yon dòz total apeprè 60 e–Å−2.
Yo te fè koreksyon mouvman pwovoke pa gwo bout bwa ak pondération dòz sou fim lè l sèvi avèk MotionCor2 nan RELION 4.061. Yo te fè estimasyon paramèt fonksyon transfè kontras (CTF) nan cryoSPARC lè l sèvi avèk metòd estimasyon CTF ki baze sou patch62. Yo te eskli fotomikwograf ki gen yon rezolisyon ajisteman CTF ≥4 Å nan analiz ki vin apre yo. Tipikman, yo te itilize yon sou-gwoup 500-1000 fotomikwograf pou seleksyon pwen nan cryoSPARC, ki te swiv pa plizyè seri klasifikasyon 2D apre filtraj pou jwenn yon imaj referans klè pou seleksyon patikil ki baze sou modèl. Apre sa, yo te ekstrè patikil yo lè l sèvi avèk bwat limit 64 piksèl ak gwoupman 4 fwa. Yo te fè plizyè seri klasifikasyon 2D pou retire kategori patikil endezirab yo. Yo te rekonstwi modèl 3D inisyal la lè l sèvi avèk rekonstriksyon ab initio epi rafine l lè l sèvi avèk rafinman non inifòm nan cryoSPARC. Yo te fè klasifikasyon 3D nan cryoSPARC oswa RELION ki baze sou eterogeneite ARD. Yo pa t obsève okenn eterogeneite siyifikatif nan domèn manbràn yo. Yo te rafine patikil yo lè l sèvi avèk metòd C1 ak C2 yo; Patikil ki gen pi gwo rezolisyon C2 yo te konsidere kòm simetrik parapò ak C2 epi yo te enpòte yo nan RELION pou rafinman Bayesyen. Apre sa, yo te transfere patikil yo tounen nan cryoSPARC pou rafinman final ki pa inifòm ak lokal. Rezolisyon final la ak kantite patikil yo montre nan Tablo 1.
Lè nou t ap trete pentamè Nan+AP yo, nou te eksplore plizyè metòd pou amelyore rezolisyon domèn manbran yo (sitou rejyon pò a), tankou soustraksyon siyal ak maskaj TMD. Sepandan, tantativ sa yo pa t reyisi akòz dezòd potansyèlman ekstrèm nan rejyon pò a ak eterogeneite jeneral TMD a. Rezolisyon final la te kalkile lè l sèvi avèk yon mask ki te pwodui otomatikman pa metòd pwosesis non inifòm nan cryoSPARC, sitou vize rejyon ARD la. Sa te reyalize yon rezolisyon siyifikativman pi wo pase sa domèn manbran yo (sitou rejyon VSLD la).
Yo te premye pwodui modèl de novo fòm apo bakteri Nanchung ak Inactive yo lè l sèvi avèk Coot63, epi yo te pwodui modèl bakteri Nan ak Iav yo lè l sèvi avèk AlphaFold264 pou idantifye rejyon ki pa gen anpil konfyans. Yo te baze modèl kalmodulin sou ajisteman kò rijid modèl ki mare Ca2+ ak modèl ki pa mare Ca2+ yo nan aksè PDB 4JPZ56 ak 1CFD65, respektivman. Yo te rafine modèl yo lè l sèvi avèk rafinman esferik pou asire estereyochimi ki kòrèk la ak bon jeyometri. Apre sa, yo te modle fosfatidilkolin, fosfatidiletanolamin, ak fosfatidilserin kòm dansite lipid byen defini, epi yo te mete ligand NAM ak AP yo nan dansite ki koresponn yo nan jonksyon sere yo. Yo te pwodui fichye kontrent yo apati chèn SMILES izofòm yo lè l sèvi avèk eLBOW nan PHENIX66. Finalman, yo te rafine modèl yo nan espas reyèl nan PHENIX lè l sèvi avèk rechèch kadriyaj lokal ak minimizasyon global ak kontrent estrikti segondè. Yo te itilize sèvè MolProbity la pou rafinman modèl la ak analiz estriktirèl la, epi yo te fè ilistrasyon yo avèk PyMOL ak UCSF Chimera X. 67,68,69 Yo te fè analiz ouvèti a avèk sèvè HOLE a,70 epi yo te fè map konsèvasyon sekans lan avèk sèvè Consurf la.71
Yo te fè analiz estatistik la avèk Igor Pro 6.2, Excel Office 365, ak GraphPad Prism 7.0. Tout done kantitatif yo prezante kòm mwayèn ± erè estanda (SEM). Yo te itilize tès t Student la (bilateral, san pè) pou konpare de gwoup yo. Yo te itilize analiz varyans yon sèl chemen (ANOVA) ki te swiv pa tès post hoc Dunnett la pou konpare plizyè gwoup. *P< 0.05, **P< 0.01, ak ***PYo te konsidere valè < 0.001 kòm estatistikman siyifikatif selon distribisyon done yo. Yo te kalkile valè Kd, Ki, ak entèval konfyans asimetrik 95% yo lè l sèvi avèk GraphPad Prism 10.
Pou plis detay sou metodoloji etid la, tanpri gade Rezime Rapò Portfolio Lanati a ki lye nan atik sa a.
Yo te konstwi modèl inisyal la lè l sèvi avèk modèl kalmodulin ki soti nan baz done PDB 4JPZ ak 1CFD yo. Yo te depoze kowòdone yo nan Bank Done Pwoteyin (PDB) anba nimewo aksè 9NVN (Nan-Iav-CaM san ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM lye ak nikotinamid), 9NVP (Nan-Iav-CaM lye ak nikotinamid ak EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM lye ak afenidolpirolin ak kalsyòm), 9NVR (Nan-Iav-CaM lye ak afenidolpirolin ak EDTA), ak 9NVS (Nan pentamè lye ak afenidolpirolin). Imaj kriyo-mikwoskòp elektwonik ki koresponn yo depoze nan Baz Done Mikwoskòp Elektwonik (EMDB) anba nimewo aksè sa yo: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM san ligand), EMD-49845 (konplèks Nan-Iav-CaM ak nikotinamid), EMD-49846 (konplèks Nan-Iav-CaM ak nikotinamid ak EDTA), EMD-49847 (konplèks Nan-Iav-CaM ak afidopirolin ak kalsyòm), EMD-49848 (konplèks Nan-Iav-CaM ak afidopirolin ak EDTA), ak EMD-49849 (konplèks Nan pentamè ak afidopirolin). Done brit pou analiz fonksyonèl la prezante nan atik sa a.
Dat piblikasyon: 28 janvye 2026