Dwòg anthelmintic N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) pwovoke anjyogenesis atravè modulation allosteric nan reseptè M3 muscarinic nan selil andotelyal yo.

  
Dwòg anthelmintic N,N-dietil-m-toluamid (DEET) yo te rapòte yo anpeche AChE (asetilkolinesteraz) epi li gen potansyèl pwopriyete kanserojèn akòz vaskularizasyon twòp. Nan papye sa a, nou montre ke DEET espesyalman stimul selil endothelial ki ankouraje anjyogenesis, kidonk ogmante kwasans timè. DEET aktive pwosesis selilè ki mennen nan anjyogenesis, ki gen ladan pwopagasyon, migrasyon, ak adezyon. Sa a asosye ak ogmante pwodiksyon NO ak ekspresyon VEGF nan selil endothelial yo. Silans M3 oswa lè l sèvi avèk inibitè M3 famasi yo aboli tout efè sa yo, sijere ke DEET-induit anjyogenesis se M3-sansib. Eksperyans ki enplike siyal kalsyòm nan selil andotelyal ak HEK ki eksprime reseptè M3, osi byen ke etid obligatwa ak debakadè, endike ke DEET aji kòm yon modulateur allosteric nan reseptè M3. Anplis de sa, DEET inibit AChE, kidonk ogmante byodisponibilite nan asetilkolin ak obligatwa li yo nan reseptè M3, ak amelyore efè proangiogenic atravè règleman allosterik.
EC prensipal yo te izole nan aorta sourit Swis yo. Metòd ekstraksyon an te adapte nan pwotokòl Kobayashi 26 . Murine EC yo te kiltive nan mwayen EBM-2 complétée ak 5% chalè-inaktive FBS jouk katriyèm pasaj la.
Efè de konsantrasyon DEET sou pwopagasyon HUVEC, U87MG, oswa BF16F10 te analize lè l sèvi avèk CyQUANT Cell Proliferation Assay Twous (Molecular Probes, C7026). Yon ti tan, yo te simen 5.103 selil pou chak pi nan yon plak 96-pi, yo te pèmèt yo tache lannwit lan, epi yo te trete ak DEET pou 24 èdtan. Apre yo fin retire mwayen kwasans lan, ajoute solisyon obligatwa lank nan chak pi nan mikroplak la epi enkube selil yo nan 37 °C pou 30 min. Nivo fliyoresan yo te detèmine lè l sèvi avèk yon lektè mikwoplak multimode Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Almay) ekipe ak filtè eksitasyon 485 nm ak filtè emisyon 530 nm.
HUVEC yo te simen nan plak 96-byen nan yon dansite 104 selil pou chak pi. Selil yo te trete ak DEET pou 24 èdtan. Vitabilite selil yo te evalye lè l sèvi avèk yon tès kolorimetrik MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Valè dansite optik yo te jwenn sou yon lektè microplate multimode (Mithras LB940) nan yon longèdonn 570 nm.
Efè DEET yo te etidye lè l sèvi avèk tès anjyogenesis in vitro. Tretman ak 10-8 M oswa 10-5 M DEET ogmante fòmasyon nan longè kapilè nan HUVECs (figi 1a, b, ba blan). Konpare ak gwoup kontwòl la, tretman ak konsantrasyon DEET sòti nan 10-14 a 10-5 M te montre ke longè kapilè a te rive nan yon plato nan 10-8 M DEET (figi siplemantè S2). Pa gen okenn diferans enpòtan yo te jwenn nan efè proangiogenic in vitro nan HUVECs trete ak DEET nan seri a konsantrasyon nan 10-8 M ak 10-5 M.
Pou detèmine efè DEET sou neovaskularizasyon, nou te fè etid neovaskularizasyon an vivo. Apre 14 jou, sourit sou fòm piki ak selil andothelial precultured ak 10-8 M oswa 10-5 M DEET te montre yon ogmantasyon siyifikatif nan kontni emoglobin (figi 1c, ba blan).
Anplis de sa, yo te etidye neovaskularizasyon DEET-pwovoke nan sourit ki gen xenograft U87MG ke yo te enjekte chak jou (ip) ak DEET nan yon dòz li te ye pou pwovoke konsantrasyon plasma nan 10-5 M, ki se nòmal nan moun ekspoze. nan 23. Timè detektab (sa vle di timè> 100 mm3) yo te obsève 14 jou apre piki selil U87MG nan sourit. Nan jou 28, kwasans timè te siyifikativman amelyore nan sourit ki trete DEET konpare ak sourit kontwòl (figi 1d, kare). Anplis de sa, CD31 tach nan timè te montre ke DEET siyifikativman ogmante zòn kapilè men se pa dansite microvessel. (figi 1e–g).
Pou detèmine wòl reseptè muscarinic nan pwopagasyon DETA-induit, yo te itilize 10-8 M oswa 10-5 M DETA nan prezans pFHHSiD (10-7 M, yon antagonist selektif reseptè M3). Tretman nan HUVEC. pFHHSiD konplètman bloke pwopriyete proliferasyon DETA nan tout konsantrasyon (Tablo 1).
Nan kondisyon sa yo, nou te egzamine tou si DEET ta ogmante longè kapilè nan selil HUVEC yo. Menm jan an tou, pFHHSiD siyifikativman anpeche longè kapilè DEET-induit (figi 1a, b, ba gri). Anplis de sa, eksperyans menm jan an te fèt ak M3 siRNA. Malgre ke siRNA kontwòl la pa t 'efektif nan fè pwomosyon fòmasyon kapilè, silans nan reseptè muscarinic M3 la aboli kapasite nan DEET ogmante longè kapilè (figi 1a, b, ba nwa).
Anplis de sa, tou de 10-8 M oswa 10-5 M DEET-induit vaskularizasyon an vitro ak neovaskularizasyon nan vivo yo te konplètman bloke pa pFHHSiD (figi 1c, d, sèk). Rezilta sa yo endike ke DEET ankouraje anjyogenesis atravè yon chemen sansib a antagonist selektif reseptè M3 oswa M3 siRNA.
AChE se sib molekilè DEET. Dwòg tankou donepezil, ki aji kòm inibitè AChE, ka ankouraje EC anjyogenesis nan vitro ak nan modèl ischemi manm dèyè sourit14. Nou teste efè de konsantrasyon DEET sou aktivite anzim AChE nan HUVEC. Ba (10-8 M) ak segondè (10-5 M) konsantrasyon DEET diminye aktivite AChE andotelyal konpare ak kondisyon kontwòl (Fig. 2).
Tou de konsantrasyon DEET (10-8 M ak 10-5 M) redwi aktivite asetilkolinesteraz sou HUVEC. BW284c51 (10-5 M) te itilize kòm yon kontwòl pou inibitè asetilkolinesteraz. Rezilta yo eksprime kòm pousantaj aktivite AChE sou HUVEC trete ak de konsantrasyon DEET yo konpare ak selil machin trete yo. Valè yo eksprime kòm mwayen ± SEM nan sis eksperyans endepandan. *p <0.05 konpare ak kontwòl (Kruskal-Wallis ak Dunn tès konparezon miltip).
Ksid nitrique (NO) patisipe nan pwosesis anjyojenik la 33, Se poutèt sa, NO pwodiksyon nan HUVECs DEET-stimulé te etidye. DEET-trete pwodiksyon NO endothelial te ogmante konpare ak selil kontwòl, men rive nan siyifikasyon sèlman nan yon dòz 10-8 M (Fig. 3c). Pou detèmine chanjman molekilè ki kontwole pwodiksyon NO DEET-induit, ekspresyon eNOS ak aktivasyon yo te analize pa Western blotting. Malgre ke tretman DEET pa t 'chanje ekspresyon eNOS, li siyifikativman ogmante fosforilasyon eNOS nan sit aktive li yo (Ser-1177) pandan y ap diminye sit inhibitory li yo (Thr-495) konpare ak selil ki pa trete nan fosforilasyon eNOS (Fig. 3d). Anplis de sa, yo te kalkile rapò fosforile eNOS nan sit aktivasyon an ak sit inhibitory apre nòmalize kantite fosforilasyon eNOS ak kantite total anzim. Rapò sa a te ogmante siyifikativman nan HUVEC yo trete ak chak konsantrasyon DEET konpare ak selil ki pa trete (Fig. 3d).
Finalman, ekspresyon VEGF, youn nan faktè prensipal proangiogenic, te analize pa Western blotting. DEET ogmante siyifikativman ekspresyon VEGF, tandiske pFHHSiD konplètman bloke ekspresyon sa a.
Piske efè DEET yo sansib a tou de blokaj famasi ak downregulation reseptè M3 yo, nou teste ipotèz ke DEET ta ka amelyore siyal kalsyòm. Surprenante, DEET echwe pou pou ogmante kalsyòm sitoplasmik nan HUVEC (done yo pa montre) ak HEK / M3 (Fig. 4a, b) pou tou de konsantrasyon yo itilize.