Medikaman antielmintik N,N-diethyl-m-toluamid la (DEET) te rapòte ke li anpeche AChE (asetilkolinesteraz) epi li gen pwopriyete kanserojèn potansyèl akòz vaskilarizasyon twòp. Nan atik sa a, nou montre ke DEET espesyalman estimile selil andotelyal ki ankouraje anjyojènèz, kidonk ogmante kwasans timè. DEET aktive pwosesis selilè ki mennen nan anjyojènèz, tankou pwoliferasyon, migrasyon, ak adezyon. Sa a asosye avèk ogmantasyon pwodiksyon NO ak ekspresyon VEGF nan selil andotelyal yo. Silansman M3 oswa itilizasyon inibitè famakolojik M3 te aboli tout efè sa yo, ki sijere ke anjyojènèz pwovoke pa DEET se M3-sansib. Eksperyans ki enplike siyalizasyon kalsyòm nan selil andotelyal ak HEK ki twòp eksprime reseptè M3, ansanm ak etid lyezon ak docking, endike ke DEET aji kòm yon modilatè alosterik nan reseptè M3. Anplis de sa, DEET anpeche AChE, kidonk ogmante byodisponibilite asetilkolin ak lyezon li ak reseptè M3 yo, epi amelyore efè proanjyojenik atravè règleman alosterik.
Yo te izole EC prensipal yo nan aòt sourit Swis. Yo te adapte metòd ekstraksyon an apati pwotokòl Kobayashi 26 la. Yo te kiltive EC murin yo nan mwayen EBM-2 complété ak 5% FBS inaktif pa chalè jiska katriyèm pasaj la.
Yo te analize efè de konsantrasyon DEET sou pwoliferasyon HUVEC, U87MG, oubyen BF16F10 lè l sèvi avèk Kit Tès Pwoliferasyon Selilè CyQUANT (Molecular Probes, C7026). An brèf, yo te simen 5.103 selil pa pi nan yon plak 96 pi, yo te kite yo tache pandan tout lannwit lan, epi answit yo te trete yo ak DEET pandan 24 èdtan. Apre yo fin retire mwayen kwasans lan, ajoute solisyon lye lank nan chak pi nan mikwoplak la epi enkube selil yo a 37 °C pandan 30 minit. Yo te detèmine nivo fliyoresans yo lè l sèvi avèk yon lektè mikwoplak multimod Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Almay) ekipe ak filtè eksitasyon 485 nm ak filtè emisyon 530 nm.
Yo te simen selil HUVEC yo nan plak 96 pi nan yon dansite 104 selil pa pi. Yo te trete selil yo ak DEET pandan 24 èdtan. Yo te evalye viabilité selilè a lè l sèvi avèk yon tès MTT kolorimetrik (Sigma-Aldrich, M5655). Yo te jwenn valè dansite optik yo sou yon lektè mikwoplak multimod (Mithras LB940) nan yon longèdonn 570 nm.
Yo te etidye efè DEET yo lè l sèvi avèk tès anjyojenèz in vitro. Tretman ak 10-8 M oswa 10-5 M DEET te ogmante fòmasyon longè kapilè nan HUVEC yo (Fig. 1a, b, ba blan). Konpare ak gwoup kontwòl la, tretman ak konsantrasyon DEET ki sòti nan 10-14 a 10-5 M te montre ke longè kapilè a te rive nan yon plato nan 10-8 M DEET (Fig. Siplemantè S2). Yo pa jwenn okenn diferans siyifikatif nan efè proanjyojenik in vitro HUVEC trete ak DEET nan seri konsantrasyon 10-8 M ak 10-5 M.
Pou detèmine efè DEET sou neovaskilarizasyon, nou te fè etid neovaskilarizasyon in vivo. Apre 14 jou, sourit yo te enjekte ak selil andotelyal prekiltive ak 10-8 M oswa 10-5 M DEET te montre yon ogmantasyon siyifikatif nan kontni emoglobin (Fig. 1c, ba blan yo).
Anplis, yo te etidye neovaskilarizasyon pwovoke pa DEET nan sourit ki gen ksenogrèf U87MG ki te resevwa enjeksyon DEET chak jou (ip) nan yon dòz ke yo konnen ki pwovoke konsantrasyon plasma 10-5 M, ki nòmal nan moun ki ekspoze. nan 23. Yo te obsève timè detektab (sa vle di timè >100 mm3) 14 jou apre enjeksyon selil U87MG nan sourit. Nan jou 28 la, kwasans timè a te ogmante anpil nan sourit trete ak DEET konpare ak sourit kontwòl yo (Fig. 1d, kare). Anplis, koloran CD31 timè yo te montre ke DEET te ogmante zòn kapilè a anpil men li pa t ogmante dansite mikwoveso yo. (Fig. 1e–g).
Pou detèmine wòl reseptè miskarinik yo nan pwoliferasyon pwovoke pa DETA, yo te itilize 10-8 M oswa 10-5 M DETA an prezans pFHHSiD (10-7 M, yon antagonis reseptè M3 selektif). Tretman HUVEC. pFHHSiD te bloke nèt pwopriyete pwoliferatif DETA yo nan tout konsantrasyon yo (Tablo 1).
Nan kondisyon sa yo, nou te egzamine tou si DEET ta ogmante longè kapilè nan selil HUVEC yo. Menm jan an tou, pFHHSiD te anpeche longè kapilè pwovoke pa DEET anpil (Fig. 1a, b, ba gri). Anplis de sa, eksperyans menm jan an te fèt ak siRNA M3. Malgre ke siRNA kontwòl la pa t efikas nan pwomosyon fòmasyon kapilè, silansman reseptè miskarinik M3 la te aboli kapasite DEET pou ogmante longè kapilè (Fig. 1a, b, ba nwa).
Anplis, tou de vaskilarizasyon pwovoke pa DEET 10-8 M oswa 10-5 M in vitro ak neovaskilarizasyon in vivo te konplètman bloke pa pFHHSiD (Fig. 1c, d, sèk). Rezilta sa yo endike ke DEET pwomote anjyojènèz atravè yon chemen sansib a antagonis reseptè M3 selektif oswa siRNA M3.
AChE se sib molekilè DEET la. Medikaman tankou donepezil, ki aji kòm inibitè AChE, ka estimile anjyojènèz EC in vitro ak nan modèl ischemi janm dèyè sourit14. Nou te teste efè de konsantrasyon DEET sou aktivite anzim AChE nan HUVEC. Konsantrasyon DEET ki ba (10-8 M) ak ki wo (10-5 M) te diminye aktivite AChE andotelyal konpare ak kondisyon kontwòl yo (Fig. 2).
Toulede konsantrasyon DEET yo (10-8 M ak 10-5 M) te diminye aktivite asetilkolinesteraz sou HUVEC. Yo te itilize BW284c51 (10-5 M) kòm yon kontwòl pou inibitè asetilkolinesteraz yo. Rezilta yo eksprime kòm pousantaj aktivite AChE sou HUVEC trete ak de konsantrasyon DEET yo konpare ak selil trete ak vektè a. Valè yo eksprime kòm mwayèn ± SEM nan sis eksperyans endepandan. *p < 0.05 konpare ak kontwòl la (tès konparezon miltip Kruskal-Wallis ak Dunn).
Oksid nitrique (NO) enplike nan pwosesis anjyojenik 33 la, kidonk, yo te etidye pwodiksyon NO nan HUVEC ki te estimile pa DEET. Pwodiksyon NO andotelyal trete ak DEET te ogmante konpare ak selil kontwòl yo, men li te rive nan siyifikasyon sèlman nan yon dòz 10-8 M (Fig. 3c). Pou detèmine chanjman molekilè ki kontwole pwodiksyon NO pwovoke pa DEET, yo te analize ekspresyon ak aktivasyon eNOS pa Western blotting. Malgre ke tretman DEET pa t chanje ekspresyon eNOS, li te ogmante fosforilasyon eNOS anpil nan sit aktivasyon li (Ser-1177) pandan l ap diminye sit inibitwa li (Thr-495) konpare ak selil ki pa trete nan fosforilasyon eNOS (Fig. 3d). Anplis de sa, yo te kalkile rapò eNOS fosforile nan sit aktivasyon an ak sit inibitwa a apre yo te fin nòmalize kantite eNOS fosforile a ak kantite total anzim lan. Rapò sa a te ogmante anpil nan HUVEC trete ak chak konsantrasyon DEET konpare ak selil ki pa trete yo (Fig. 3d).
Finalman, yo te analize ekspresyon VEGF, youn nan prensipal faktè proanjyojenik yo, pa Western blotting. DEET te ogmante ekspresyon VEGF anpil, alòske pFHHSiD te bloke ekspresyon sa a nèt.
Piske efè DEET yo sansib a tou de blokaj famakolojik ak diminisyon reseptè M3 yo, nou te teste ipotèz ke DEET ta ka amelyore siyalizasyon kalsyòm. Etonan, DEET pa t rive ogmante kalsyòm sitoplasmik nan HUVEC (done yo pa montre) ak HEK/M3 (Fig. 4a, b) pou tou de konsantrasyon yo te itilize yo.
Dat piblikasyon: 30 Desanm 2024