Kwasans meristèm apikal tij (SAM) enpòtan anpil pou achitekti tij la. Òmòn plant yogiberelin(GAs) yo jwe yon wòl kle nan kowòdinasyon kwasans plant yo, men wòl yo nan SAM la rete mal konprann. La a, nou te devlope yon biosansè ratiometrik pou siyalizasyon GA lè nou te modifye pwoteyin DELLA a pou siprime fonksyon regilasyon esansyèl li nan repons transkripsyon GA a tout pandan y ap prezève degradasyon li lè yo rekonèt GA. Nou demontre ke biosansè ki baze sou degradasyon sa a anrejistre avèk presizyon chanjman nan nivo GA ak deteksyon selilè pandan devlopman. Nou te itilize biosansè sa a pou kat aktivite siyalizasyon GA nan SAM la. Nou montre ke siyal GA ki wo yo prezan prensipalman nan selil ki sitiye ant primordia ògàn yo, ki se prekisè selil internoud yo. Lè nou itilize apwòch genyen ak pèt fonksyon, nou demontre tou ke GA reglemante oryantasyon plan divizyon selilè a, etabli òganizasyon selilè kanonik internoud yo, kidonk ankouraje spesifikasyon internoud nan SAM la.
Meristèm apikal tij la (SAM), ki sitiye nan somè tij la, gen yon nich selil souch ki gen aktivite ki jenere ògàn lateral ak ne tij nan yon fason modilè ak iteratif pandan tout lavi plant lan. Chak inite repetitif sa yo, oswa ne plant yo, gen ladan yo internodal ak ògàn lateral nan ne yo, ak meristèm aksilè nan esèl fèy yo1. Kwasans ak òganizasyon ne plant yo chanje pandan devlopman. Nan Arabidopsis, kwasans internodal la siprime pandan etap vejetatif la, epi meristèm aksilè yo rete andòmi nan esèl fèy rozèt yo. Pandan tranzisyon an nan faz floral la, SAM la vin meristèm enfloresans lan, ki jenere internodal long ak boujon aksilè, ti branch nan esèl fèy koulin yo, epi pita, flè san fèy2. Malgre ke nou te fè pwogrè siyifikatif nan konpreyansyon mekanis ki kontwole inisyasyon fèy, flè ak branch yo, nou konnen relativman ti kras sou fason internodal yo leve.
Konprann distribisyon espasyotanporèl GA yo ap ede pi byen konprann fonksyon òmòn sa yo nan diferan tisi ak nan diferan etap devlopman. Vizyalizasyon degradasyon fizyon RGA-GFP ki eksprime anba aksyon pwòp pwomotè li a bay enfòmasyon enpòtan sou règleman nivo total GA nan rasin yo15,16. Sepandan, ekspresyon RGA varye selon tisi yo17 epi li reglemante pa GA18. Kidonk, ekspresyon diferansyèl pwomotè RGA a ka lakòz modèl fluoresans yo obsève ak RGA-GFP e konsa metòd sa a pa kantitatif. Plis dènyèman, GA19,20 ki make ak fluorescein bioaktif (Fl) te revele akimilasyon GA nan andokòtèks rasin lan ak règleman nivo selilè li yo pa transpò GA. Dènyèman, detèktè GA FRET nlsGPS1 la te montre ke nivo GA yo korele ak elongasyon selilè nan rasin, filaman, ak ipokotil ki grandi nan nwa21. Sepandan, jan nou te wè a, konsantrasyon GA a se pa sèl paramèt ki kontwole aktivite siyalizasyon GA a, paske li depann de pwosesis deteksyon konplèks. Isit la, apiye sou konpreyansyon nou sou chemen siyalizasyon DELLA ak GA yo, nou rapòte devlopman ak karakterizasyon yon biosansè ratiometrik ki baze sou degradasyon pou siyalizasyon GA. Pou devlope biosansè kantitatif sa a, nou te itilize yon RGA mutant sansib a GA ki te fizyone ak yon pwoteyin fliyoresan epi ki te omniprésente nan tisi yo, ansanm ak yon pwoteyin fliyoresan ki pa sansib a GA. Nou montre ke fizyon pwoteyin RGA mutant yo pa entèfere ak siyalizasyon GA andojèn lè yo omniprésente, epi ke biosansè sa a ka mezire aktivite siyalizasyon ki soti nan tou de opinyon GA ak pwosesis siyal GA pa aparèy deteksyon an ak yon rezolisyon espasyotanporèl ki wo. Nou te itilize biosansè sa a pou trase distribisyon espasyotanporèl aktivite siyalizasyon GA a epi mezire kijan GA kontwole konpòtman selilè nan epidèm SAM lan. Nou demontre ke GA kontwole oryantasyon plan divizyon selil SAM ki sitiye ant primordia ògàn yo, kidonk defini òganizasyon selilè kanonik internod la.
Finalman, nou te mande si qmRGA te kapab rapòte chanjman nan nivo GA andojèn lè l sèvi avèk ipokotil k ap grandi. Nou te deja montre ke nitrat stimul kwasans lan lè li ogmante sentèz GA e, kidonk, degradasyon DELLA34. Kidonk, nou te obsève ke longè ipokotil nan plantules pUBQ10::qmRGA ki grandi anba yon rezèv nitrat abondan (10 mM NO3−) te siyifikativman pi long pase sa ki nan plantules ki grandi anba kondisyon ki pa gen nitrat (Fig. Siplemantè 6a). An akò avèk repons kwasans lan, siyal GA yo te pi wo nan ipokotil plantules ki grandi anba kondisyon 10 mM NO3− pase nan plantules ki grandi san nitrat (Fig. Siplemantè 6b, c). Kidonk, qmRGA pèmèt tou siveyans chanjman nan siyal GA ki pwovoke pa chanjman andojèn nan konsantrasyon GA.
Pou konprann si aktivite siyalizasyon GA detekte pa qmRGA a depann de konsantrasyon GA ak pèsepsyon GA, jan yo te prevwa dapre konsepsyon detèktè a, nou te analize ekspresyon twa reseptè GID1 yo nan tisi vejetatif ak repwodiktif yo. Nan plantules yo, liy rapòtè GID1-GUS la te montre ke GID1a ak c te trè eksprime nan kotiledon yo (Fig. 3a-c). Anplis de sa, tout twa reseptè yo te eksprime nan fèy yo, primordia rasin lateral yo, pwent rasin yo (eksepte pou bouchon rasin GID1b la), ak sistèm vaskilè a (Fig. 3a-c). Nan SAM enfloresans lan, nou te detekte siyal GUS sèlman pou GID1b ak 1c (Fig. siplemantè 7a-c). Ibridasyon in situ te konfime modèl ekspresyon sa yo epi li te demontre plis ke GID1c te eksprime inifòmman nan nivo ki ba nan SAM lan, tandiske GID1b te montre pi gwo ekspresyon nan periferi SAM lan (Fig. siplemantè 7d-l). Fizyon tradiksyonèl pGID1b::2xmTQ2-GID1b la te revele tou yon seri gradyèl nan ekspresyon GID1b, soti nan yon ekspresyon ki ba oswa ki pa genyen nan sant SAM lan rive nan yon ekspresyon ki wo nan fwontyè ògàn yo (Fig. siplemantè 7m). Kidonk, reseptè GID1 yo pa distribye inifòmman atravè ak nan tisi yo. Nan eksperyans ki vin apre yo, nou te obsève tou ke surekspresyon GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) te ogmante sansiblite qmRGA nan ipokotil yo pou aplikasyon GA ekstèn (Fig. 3d, e). Okontrè, fluoresans ki mezire pa qd17mRGA nan ipokotil la te ensansib a tretman GA3 (Fig. 3f, g). Pou tou de tès yo, plantules yo te trete ak gwo konsantrasyon GA (100 μM GA3) pou evalye konpòtman rapid detèktè a, kote kapasite pou lye ak reseptè GID1 la te ogmante oswa pèdi. Ansanm, rezilta sa yo konfime ke biosansè qmRGA a sèvi yon fonksyon konbine kòm yon detèktè GA ak GA, epi sijere ke ekspresyon diferansyèl reseptè GID1 la ka modifye emisivite detèktè a yon fason siyifikatif.
Jiska prezan, distribisyon siyal GA yo nan SAM lan rete enkoni. Se poutèt sa, nou te itilize plant ki eksprime qmRGA ak rapòtè selil souch pCLV3::mCherry-NLS35 pou kalkile kat kantitatif wo rezolisyon nan aktivite siyal GA, konsantre sou kouch L1 la (epidèm; Fig. 4a, b, gade Metòd ak Metòd Siplemantè), piske L1 jwe yon wòl kle nan kontwole kwasans SAM36. La a, ekspresyon pCLV3::mCherry-NLS te bay yon pwen referans jeyometrik fiks pou analize distribisyon espasyotanporèl aktivite siyal GA37. Malgre ke GA konsidere kòm esansyèl pou devlopman ògàn lateral4, nou te obsève ke siyal GA yo te ba nan primordyòm floral la (P) apati etap P3 la (Fig. 4a, b), tandiske primordyòm P1 ak P2 jèn yo te gen yon aktivite modere menm jan ak sa ki nan rejyon santral la (Fig. 4a, b). Yo te detekte yon aktivite siyalizasyon GA ki pi wo nan limit primordyòm ògàn yo, kòmanse nan P1/P2 (sou kote limit la) epi rive nan pik li nan P4, osi byen ke nan tout selil rejyon periferik ki sitiye ant primordyòm yo (Fig. 4a, b ak Fig. Siplemantè 8a, b). Yo te obsève aktivite siyalizasyon GA ki pi wo sa a pa sèlman nan epidèm nan, men tou nan kouch L2 ak kouch siperyè L3 yo (Fig. Siplemantè 8b). Modèl siyal GA yo detekte nan SAM lè l sèvi avèk qmRGA a te rete san chanjman tou sou tan (Fig. Siplemantè 8c-f, k). Malgre ke konstriksyon qd17mRGA a te sistematikman diminye nan SAM plant T3 yo ki soti nan senk liy endepandan ke nou te karakterize an detay, nou te kapab analize modèl fluoresans yo te jwenn ak konstriksyon pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP a (Fig. Siplemantè 8g-j, l). Nan liy kontwòl sa a, se sèlman ti chanjman nan rapò fluoresans lan ki te detekte nan SAM lan, men nan sant SAM lan nou te obsève yon diminisyon klè ak inatandi nan VENUS ki asosye avèk TagBFP. Sa konfime ke modèl siyalizasyon ke qmRGA obsève a reflete degradasyon mRGA-VENUS ki depann de GA, men li demontre tou ke qmRGA ka souzestime aktivite siyalizasyon GA nan sant meristèm lan. An rezime, rezilta nou yo revele yon modèl siyalizasyon GA ki reflete prensipalman distribisyon primordyòm yo. Distribisyon rejyon entè-primordiyal (IPR) sa a se akòz etablisman gradyèl yon aktivite siyalizasyon GA ki wo ant primordyòm k ap devlope a ak rejyon santral la, pandan ke an menm tan aktivite siyalizasyon GA nan primordyòm lan diminye (Fig. 4c, d).
Distribisyon reseptè GID1b ak GID1c yo (gade pi wo a) sijere ke ekspresyon diferansyèl reseptè GA yo ede fòme modèl aktivite siyal GA nan SAM lan. Nou te mande tèt nou si akimilasyon diferansyèl GA a ta ka enplike. Pou envestige posibilite sa a, nou te itilize detèktè nlsGPS1 GA FRET21 la. Yo te detekte yon ogmantasyon nan frekans aktivasyon nan SAM nlsGPS1 trete ak 10 μM GA4+7 pandan 100 min (Fig. Siplemantè 9a-e), sa ki endike ke nlsGPS1 reponn a chanjman nan konsantrasyon GA nan SAM lan, menm jan li fè sa nan rasin21. Distribisyon espasyal frekans aktivasyon nlsGPS1 te revele nivo GA relativman ba nan kouch ekstèn SAM lan, men li te montre ke yo te wo nan sant la ak nan fwontyè SAM lan (Fig. 4e ak Fig. Siplemantè 9a,c). Sa sijere ke GA distribye tou nan SAM lan ak yon modèl espasyal konparab ak sa ki revele pa qmRGA. Kòm yon apwòch konplemantè, nou te trete SAM lan tou avèk GA fliyoresan (GA3-, GA4-, GA7-Fl) oubyen Fl poukont li kòm yon kontwòl negatif. Siyal Fl la te distribye nan tout SAM lan, ki gen ladan rejyon santral la ak primordyòm nan, byenke nan yon entansite ki pi ba (Fig. 4j ak Fig. Siplemantè 10d). Okontrè, tout twa GA-Fl yo te akimile espesyalman nan fwontyè primordyòm yo e nan diferan degre nan rès IPR a, avèk GA7-Fl ki te akimile nan pi gwo domèn nan IPR a (Fig. 4k ak Fig. Siplemantè 10a,b). Kantifikasyon entansite fliyoresans lan te revele ke rapò entansite IPR ak non-IPR te pi wo nan SAM trete ak GA-Fl konpare ak SAM trete ak Fl (Fig. 4l ak Fig. Siplemantè 10c). Ansanm, rezilta sa yo sijere ke GA prezan nan pi gwo konsantrasyon nan selil IPR ki sitiye pi pre fwontyè ògàn nan. Sa sijere ke modèl aktivite siyalizasyon GA nan SAM lan soti tou de ekspresyon diferansyèl reseptè GA yo ak akimilasyon diferansyèl GA nan selil IPR toupre fwontyè ògàn yo. Kidonk, analiz nou an te revele yon modèl espasyotanporèl inatandi nan siyalizasyon GA, ak yon aktivite ki pi ba nan sant la ak primordyòm SAM lan ak yon aktivite ki pi wo nan IPR nan rejyon periferik la.
Pou nou konprann wòl aktivite siyalizasyon diferansyèl GA nan SAM lan, nou te analize korelasyon ki genyen ant aktivite siyalizasyon GA, ekspansyon selilè, ak divizyon selilè lè nou te itilize imaj time-lapse an tan reyèl nan SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Etandone wòl GA nan regilasyon kwasans lan, nou te espere yon korelasyon pozitif ak paramèt ekspansyon selilè yo. Se poutèt sa, nou te premye konpare kat aktivite siyalizasyon GA yo ak kat to kwasans sifas selilè (kòm yon proksi pou fòs ekspansyon selilè pou yon selil bay ak pou selil pitit fi nan divizyon) ak ak kat anizotropi kwasans, ki mezire direksyonalite ekspansyon selilè (yo itilize tou isit la pou yon selil bay ak pou selil pitit fi nan divizyon; Fig. 5a,b, gade Metòd ak Metòd Siplemantè). Kat nou yo sou to kwasans sifas selilè SAM yo konsistan avèk obsèvasyon anvan yo38,39, ak to kwasans minimòm nan fwontyè a ak to kwasans maksimòm nan flè k ap devlope (Fig. 5a). Analiz eleman prensipal (PCA) te montre ke aktivite siyalizasyon GA te gen yon korelasyon negatif ak entansite kwasans sifas selilè (Figi 5c). Nou te montre tou ke prensipal aks varyasyon yo, ki gen ladan opinyon siyal GA ak entansite kwasans, te ortogonal ak direksyon detèmine pa gwo ekspresyon CLV3, sa ki konfime esklizyon selil yo nan sant SAM nan analiz ki rete yo. Analiz korelasyon Spearman te konfime rezilta PCA yo (Figi 5d), sa ki endike ke siyal GA ki pi wo nan IPR a pa t lakòz yon pi gwo ekspansyon selilè. Sepandan, analiz korelasyon an te revele yon ti korelasyon pozitif ant aktivite siyal GA ak anizotropi kwasans (Figi 5c, d), sa ki sijere ke pi gwo siyal GA nan IPR a enfliyanse direksyon kwasans selilè a e petèt pozisyon plan divizyon selilè a.
a, b Kat chalè kwasans sifas mwayèn (a) ak anizotropi kwasans (b) nan SAM an mwayèn sou sèt plant endepandan (itilize kòm proksi pou fòs ak direksyon ekspansyon selilè, respektivman). c Analiz PCA te enkli varyab sa yo: siyal GA, entansite kwasans sifas, anizotropi kwasans sifas, ak ekspresyon CLV3. Konpozan PCA 1 te sitou korele negatifman ak entansite kwasans sifas epi pozitivman korele ak siyal GA. Konpozan PCA 2 te sitou korele pozitivman ak anizotropi kwasans sifas epi negatifman korele ak ekspresyon CLV3. Pousantaj yo reprezante varyasyon ki eksplike pa chak konpozan. d Analiz korelasyon Spearman ant siyal GA, entansite kwasans sifas, ak anizotropi kwasans sifas nan echèl tisi a eksepte CZ. Nimewo ki adwat la se valè rho Spearman ant de varyab yo. Asterisk yo endike ka kote korelasyon/korelasyon negatif la trè siyifikatif. e Vizyalizasyon 3D selil Col-0 SAM L1 pa mikwoskopi konfokal. Nouvo mi selilè ki fòme nan SAM lan (men pa primordyòm nan) a 10 èdtan yo gen koulè selon valè ang yo. Ba koulè a parèt nan kwen anba dwat la. Desen anndan an montre imaj 3D ki koresponn lan a 0 èdtan. Eksperyans lan te repete de fwa avèk rezilta menm jan an. f Dyagram bwat yo montre to divizyon selilè nan IPR ak non-IPR Col-0 SAM (n = 10 plant endepandan). Liy santral la montre medyàn lan, epi limit bwat yo endike 25yèm ak 75yèm persentil yo. Moustach yo endike valè minimòm ak maksimòm yo detèmine avèk lojisyèl R la. Valè P yo te jwenn avèk tès t bilateral Welch la. g, h Dyagram eskematik ki montre (g) kijan pou mezire ang nouvo miray selilè a (magenta) parapò ak direksyon radyal la soti nan sant SAM lan (liy pwen blan) (sèlman valè ang egi, sa vle di, 0–90°, yo konsidere), ak (h) direksyon sikonferansyèl/lateral ak radyal yo nan meristèm lan. i Istogram frekans oryantasyon plan divizyon selilè atravè SAM lan (ble fonse), IPR (ble mwayen), ak non-IPR (ble klè), respektivman. Yo te jwenn valè P yo pa yon tès Kolmogorov-Smirnov bilateral. Yo te repete eksperyans lan de fwa avèk rezilta menm jan an. j Istogram frekans oryantasyon plan divizyon selilè IPR a ozalantou P3 (vèt klè), P4 (vèt mwayen), ak P5 (vèt fonse), respektivman. Yo te jwenn valè P yo pa yon tès Kolmogorov-Smirnov bilateral. Yo te repete eksperyans lan de fwa avèk rezilta menm jan an.
Se poutèt sa, nou te envestige korelasyon ki genyen ant siyalizasyon GA ak aktivite divizyon selilè a lè nou te idantifye miray selilè ki fèk fòme pandan tès la (Fig. 5e). Apwòch sa a te pèmèt nou mezire frekans ak direksyon divizyon selilè a. Etonan, nou te jwenn ke frekans divizyon selilè nan IPR a ak rès SAM lan (ki pa IPR, Fig. 5f) te sanble, sa ki endike ke diferans nan siyalizasyon GA ant selil IPR ak selil ki pa IPR yo pa afekte divizyon selilè yon fason siyifikatif. Sa a, ak korelasyon pozitif ant siyalizasyon GA ak anizotropi kwasans lan, te pouse nou konsidere si aktivite siyalizasyon GA a te kapab enfliyanse oryantasyon plan divizyon selilè a. Nou mezire oryantasyon nouvo miray selilè a kòm yon ang egi parapò ak aks radyal ki konekte sant meristèm lan ak sant nouvo miray selilè a (Fig. 5e-i) epi nou obsève yon tandans klè pou selil yo divize nan ang ki pre 90° parapò ak aks radyal la, ak pi gwo frekans yo obsève nan 70–80° (23.28%) ak 80–90° (22.62%) (Fig. 5e,i), ki koresponn ak divizyon selilè nan direksyon sikonferansyèl/transvèsal la (Fig. 5h). Pou egzamine kontribisyon siyalizasyon GA nan konpòtman divizyon selilè sa a, nou analize paramèt divizyon selilè nan IPR ak non-IPR separeman (Fig. 5i). Nou obsève ke distribisyon ang divizyon an nan selil IPR yo diferan de sa ki nan selil ki pa IPR yo oubyen nan selil ki nan tout SAM nan, ak selil IPR yo ki montre yon pi gwo pwopòsyon divizyon selilè lateral/sikilè, sa vle di, 70–80° ak 80–90° (33.86% ak 30.71%, respektivman, pwopòsyon korespondan) (Fig. 5i). Kidonk, obsèvasyon nou yo revele yon asosyasyon ant yon siyalizasyon GA ki wo ak yon oryantasyon plan divizyon selilè ki pre direksyon sikonferansyèl la, menm jan ak korelasyon ki genyen ant aktivite siyalizasyon GA ak anizotropi kwasans (Fig. 5c, d). Pou etabli plis konsèvasyon espasyal asosyasyon sa a, nou mezire oryantasyon plan divizyon an nan selil IPR ki antoure primordyòm nan apati P3, piske yo te detekte pi gwo aktivite siyalizasyon GA nan rejyon sa a apati P4 (Fig. 4). Ang divizyon IPR yo ozalantou P3 ak P4 pa montre okenn diferans estatistikman siyifikatif, byenke yo te obsève yon ogmantasyon nan frekans divizyon selilè lateral nan IPR ozalantou P4 (Fig. 5j). Sepandan, nan selil IPR yo ozalantou P5, diferans nan oryantasyon plan divizyon selilè a te vin estatistikman siyifikatif, ak yon ogmantasyon byen file nan frekans divizyon selilè transvèsal yo (Fig. 5j). Ansanm, rezilta sa yo sijere ke siyalizasyon GA ka kontwole oryantasyon divizyon selilè nan SAM lan, ki konsistan avèk rapò anvan yo40,41 ki di ke yon siyalizasyon GA ki wo ka pwovoke oryantasyon lateral divizyon selilè nan IPR lan.
Yo prevwa ke selil ki nan IPR yo p ap enkòpore nan primordia yo men pito nan internodes yo2,42,43. Oryantasyon transvèsal divizyon selilè yo nan IPR a ka lakòz òganizasyon tipik ranje longitudinal paralèl selil epidèm yo nan internodes yo. Obsèvasyon nou yo ki dekri pi wo a sijere ke siyalizasyon GA a gen anpil chans jwe yon wòl nan pwosesis sa a lè li reglemante direksyon divizyon selilè a.
Pèt fonksyon plizyè jèn DELLA lakòz yon repons GA konstititif, epi mutan della yo ka itilize pou teste ipotèz sa a44. Nou te premye analize modèl ekspresyon senk jèn DELLA nan SAM lan. Fizyon transkripsyon liy GUS la45 te revele ke GAI, RGA, RGL1, ak RGL2 (nan yon pi piti limit) te eksprime nan SAM lan (Fig. Siplemantè 11a-d). Ibridasyon in situ te demontre tou ke ARNm GAI a akimile espesyalman nan primordia ak flè k ap devlope (Fig. Siplemantè 11e). Yo te detekte ARNm RGL1 ak RGL3 nan tout kanopi SAM lan ak nan flè ki pi gran yo, tandiske ARNm RGL2 te pi abondan nan rejyon fwontyè a (Fig. Siplemantè 11f-h). Imaj konfokal pRGL3::RGL3-GFP SAM te konfime ekspresyon ki te obsève pa ibridasyon in situ a epi li te montre ke pwoteyin RGL3 a akimile nan pati santral SAM lan (Fig. Siplemantè 11i). Lè nou te itilize liy pRGA::GFP-RGA a, nou te jwenn tou ke pwoteyin RGA a akimile nan SAM lan, men abondans li diminye nan fwontyè a apati P4 (Fig. Siplemantè 11j). Li enpòtan pou note ke modèl ekspresyon RGL3 ak RGA yo konsistan avèk yon aktivite siyalizasyon GA ki pi wo nan IPR a, jan qmRGA detekte l (Fig. 4). Anplis, done sa yo endike ke tout DELLA yo eksprime nan SAM lan epi ke ekspresyon yo ansanm kouvri tout SAM lan.
Apre sa, nou te analize paramèt divizyon selilè yo nan SAM tip sovaj la (Ler, kontwòl) ak mutan gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) yo (Fig. 6a, b). Sa ki enteresan, nou te obsève yon chanjman estatistikman siyifikatif nan distribisyon frekans ang divizyon selilè yo nan SAM mutan della global la konpare ak tip sovaj la (Fig. 6c). Chanjman sa a nan mutan della global la te akòz yon ogmantasyon nan frekans ang 80-90° yo (34.71% vs. 24.55%) epi, nan yon pi piti mezi, ang 70-80° yo (23.78% vs. 20.18%), sa vle di, ki koresponn ak divizyon selilè transvèsal yo (Fig. 6c). Frekans divizyon ki pa transvèsal yo (0-60°) te pi ba tou nan mutan della global la (Fig. 6c). Frekans divizyon selilè transvèsal yo te ogmante siyifikativman nan SAM mutan della global la (Fig. 6b). Frekans divizyon selilè transvèsal yo nan IPR a te pi wo tou nan mutant della global la konpare ak kalite sovaj la (Fig. 6d). An deyò rejyon IPR a, kalite sovaj la te gen yon distribisyon ang divizyon selilè ki pi inifòm, alòske mutant della global la te prefere divizyon tanjansyèl tankou IPR a (Fig. 6e). Nou te mezire tou oryantasyon divizyon selilè yo nan SAM mutant senkantyèl ga2 oksidaz (ga2ox) yo (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, ak ga2ox6-2), yon background mutant inaktif GA kote GA akimile. An akò avèk ogmantasyon nivo GA yo, SAM enfloresans mutant senktup ga2ox la te pi gwo pase sa Col-0 la (Fig. Siplemantè 12a, b), epi konpare ak Col-0, SAM senktup ga2ox la te montre yon distribisyon ang divizyon selilè ki byen diferan, ak frekans ang lan ki ogmante soti nan 50° a 90°, sa vle di ankò an favè divizyon tanjansyèl yo (Fig. Siplemantè 12a-c). Kidonk, nou montre ke aktivasyon konstitif siyalizasyon GA ak akimilasyon GA pwovoke divizyon selilè lateral nan IPR a ak rès SAM lan.
a, b Vizyalizasyon 3D kouch L1 SAM Ler (a) ak mutant della global (b) ki kolore ak PI lè l sèvi avèk mikwoskòp konfokal. Nouvo mi selilè ki fòme nan SAM nan (men pa primordyòm nan) sou yon peryòd 10 èdtan yo montre epi yo kolore selon valè ang yo. Ankadreman an montre SAM nan 0 èdtan. Ba koulè a parèt nan kwen anba dwat la. Flèch ki nan (b) la montre yon egzanp fichye selilè aliyen nan mutant della global la. Eksperyans lan te repete de fwa avèk rezilta menm jan an. konparezon distribisyon frekans oryantasyon plan divizyon selilè nan tout SAM nan (d), IPR (e), ak non-IPR (f) ant Ler ak della global. Valè P yo te jwenn lè l sèvi avèk yon tès Kolmogorov-Smirnov bilateral. f, g Vizyalizasyon 3D imaj konfokal SAM ki kolore ak PI nan plant transjenik Col-0 (i) ak pCUC2::gai-1-VENUS (j). Panèl yo (a, b) montre nouvo mi selilè (men pa primordia) ki te fòme nan SAM nan lespas 10 èdtan. Eksperyans lan te repete de fwa avèk rezilta menm jan an. h–j Konparezon distribisyon frekans oryantasyon plan divizyon selilè ki sitiye nan tout SAM (h), IPR (i) ak non-IPR (j) ant plant Col-0 ak pCUC2::gai-1-VENUS yo. Valè P yo te jwenn lè l sèvi avèk yon tès Kolmogorov-Smirnov bilateral.
Apre sa, nou te teste efè inibisyon siyalizasyon GA espesyalman nan IPR a. Pou rezon sa a, nou te itilize pwomotè tas kotiledon 2 (CUC2) pou kondwi ekspresyon yon pwoteyin gai-1 negatif dominan ki fizyone ak VENUS (nan liy pCUC2::gai-1-VENUS). Nan SAM tip sovaj la, pwomotè CUC2 a kondwi ekspresyon pifò IPR yo nan SAM a, ki gen ladan selil fwontyè yo, apati P4, epi yo te obsève yon ekspresyon espesifik menm jan an nan plant pCUC2::gai-1-VENUS yo (gade anba a). Distribisyon ang divizyon selilè atravè SAM oswa IPR plant pCUC2::gai-1-VENUS yo pa te siyifikativman diferan de sa ki nan tip sovaj la, byenke sanzatann nou te jwenn ke selil san yon IPR nan plant sa yo te divize nan yon frekans ki pi wo, 80-90° (Fig. 6f-j).
Yo te sijere ke direksyon divizyon selilè a depann de jeyometri SAM lan, an patikilye estrès tansyon ki pwodui pa koubi tisi a46. Se poutèt sa, nou te mande si fòm SAM lan te chanje nan plant mutant della global la ak pCUC2::gai-1-VENUS yo. Jan yo te rapòte deja12, gwosè SAM mutant della global la te pi gwo pase sa ki nan kalite sovaj la (Fig. siplemantè 13a, b, d). Ibridasyon in situ CLV3 ak STM RNA te konfime ekspansyon meristèm nan mutant della yo epi li te montre tou ekspansyon lateral nich selil souch la (Fig. siplemantè 13e, f, h, i). Sepandan, koubi SAM lan te sanble nan tou de jenotip yo (Fig. siplemantè 13k, m, n, p). Nou te obsève yon ogmantasyon menm jan an nan gwosè nan mutant gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple san yon chanjman nan koubi konpare ak kalite sovaj la (Fig. siplemantè 13c, d, g, j, l, o, p). Frekans oryantasyon divizyon selilè a te afekte tou nan mutant della quadruple la, men nan yon pi piti mezi pase nan mutant della monolitik la (Fig. Siplemantè 12d-f). Efè dòz sa a, ansanm ak mank yon efè sou koubi, sijere ke aktivite RGL3 rezidyèl nan mutant Della quadruple la limite chanjman nan oryantasyon divizyon selilè ki koze pa pèt aktivite DELLA epi ke chanjman nan divizyon selilè lateral yo rive an repons a chanjman nan aktivite siyalizasyon GA olye ke chanjman nan jeyometri SAM. Jan sa dekri pi wo a, pwomotè CUC2 a kondwi ekspresyon IPR nan SAM a kòmanse nan P4 (Fig. Siplemantè 14a, b), e okontrè, pCUC2::gai-1-VENUS SAM nan te gen yon gwosè redwi men yon koubi ki pi wo (Fig. Siplemantè 14c-h). Chanjman sa a nan mòfoloji pCUC2::gai-1-VENUS SAM ka lakòz yon distribisyon diferan nan estrès mekanik konpare ak kalite sovaj la, kote estrès sikonferansyèl ki wo yo kòmanse nan yon distans ki pi kout soti nan sant SAM nan47. Yon lòt bò, chanjman nan mòfoloji pCUC2::gai-1-VENUS SAM yo ka soti nan chanjman nan pwopriyete mekanik rejyonal yo ki pwovoke pa ekspresyon transjèn48. Nan tou de ka yo, sa a te kapab konpanse an pati efè chanjman nan siyalizasyon GA yo lè li ogmante pwobabilite pou selil yo divize nan oryantasyon sikonferansyèl/transvèsal la, sa ki eksplike obsèvasyon nou yo.
Lè nou mete tout ansanm, done nou yo konfime ke yon siyalizasyon GA ki pi wo jwe yon wòl aktif nan oryantasyon lateral plan divizyon selilè a nan IPR a. Yo montre tou ke koube meristèm nan enfliyanse oryantasyon plan divizyon selilè a nan IPR a tou.
Oryantasyon transvèsal plan divizyon an nan IPR a, akòz gwo aktivite siyalizasyon GA a, sijere ke GA pre-òganize yon fichye selilè radyal nan epidèm lan nan SAM lan pou defini òganizasyon selilè ki pral pita jwenn nan internod epidèm lan. Anfèt, fichye selilè sa yo te souvan vizib nan imaj SAM nan mutan della global yo (Fig. 6b). Kidonk, pou nou eksplore pi lwen fonksyon devlopman modèl espasyal siyalizasyon GA nan SAM lan, nou te itilize imaj time-lapse pou analize òganizasyon espasyal selil yo nan IPR nan plant tip sovaj (Ler ak Col-0), mutan della global yo, ak plant transjenik pCUC2::gai-1-VENUS yo.
Nou te jwenn ke qmRGA te montre ke aktivite siyalizasyon GA nan IPR a ogmante soti nan P1/P2 epi li rive nan pik li nan P4, epi modèl sa a rete konstan sou tan (Fig. 4a-f ak Fig. Siplemantè 8c-f, k). Pou analize òganizasyon espasyal selil yo nan IPR a ak ogmantasyon siyal GA a, nou te make selil Ler IPR yo anwo ak sou kote P4 yo dapre sò devlopman yo analize 34 èdtan apre premye obsèvasyon an, sa vle di, plis pase de fwa plastid, sa ki pèmèt nou swiv selil IPR yo pandan devlopman primordyòm nan soti nan P1/P2 rive nan P4. Nou te itilize twa koulè diferan: jòn pou selil sa yo ki te entegre nan primordyòm nan toupre P4, vèt pou sa yo ki te nan IPR a, ak koulè wouj violèt pou sa yo ki te patisipe nan tou de pwosesis yo (Fig. 7a-c). Nan t0 (0 h), 1-2 kouch selil IPR te vizib devan P4 (Fig. 7a). Jan yo te espere a, lè selil sa yo te divize, yo te fè sa sitou atravè plan divizyon transvèsal la (Fig. 7a-c). Yo te jwenn rezilta menm jan an lè yo te itilize Col-0 SAM (konsantre sou P3, ki gen fwontyè a pliye menm jan ak P4 nan Ler), byenke nan jenotip sa a, pli ki te fòme nan fwontyè floral la te kache selil IPR yo pi vit (Fig. 7g-i). Kidonk, modèl divizyon selil IPR yo pre-òganize selil yo an ranje radyal, tankou nan internodal yo. Òganizasyon ranje radyal yo ak lokalizasyon selil IPR ant ògàn siksesif yo sijere ke selil sa yo se pwogéniteur internodal.
La a, nou te devlope yon biosansè siyalizasyon GA ratiometrik, qmRGA, ki pèmèt yon katografi kantitatif aktivite siyalizasyon GA ki soti nan konsantrasyon GA ak reseptè GA konbine pandan y ap minimize entèferans ak chemen siyalizasyon andojèn yo, kidonk bay enfòmasyon sou fonksyon GA nan nivo selilè a. Pou sa, nou te konstwi yon pwoteyin DELLA modifye, mRGA, ki pèdi kapasite pou lye ak patnè entèraksyon DELLA yo men ki rete sansib a pwoteyoliz pwovoke pa GA. qmRGA reponn a chanjman ekzojèn ak andojèn nan nivo GA yo, epi pwopriyete deteksyon dinamik li yo pèmèt evalyasyon chanjman espasyotanporèl nan aktivite siyalizasyon GA pandan devlopman. qmRGA se tou yon zouti trè fleksib paske li ka adapte ak diferan tisi lè w chanje pwomotè ki itilize pou ekspresyon li (si sa nesesè), epi etandone nati konsève chemen siyalizasyon GA a ak motif PFYRE a atravè anjyospèm yo, li gen anpil chans pou l ka transfere nan lòt espès yo22. An akò avèk sa, yon mitasyon ekivalan nan pwoteyin diri SLR1 DELLA (HYY497AAA) te montre tou ke li siprime aktivite represè kwasans SLR1 pandan ke li sèlman diminye yon ti kras degradasyon li ki medyatè pa GA, menm jan ak mRGA23. Li enpòtan pou note ke etid resan nan Arabidopsis te montre ke yon sèl mitasyon asid amine nan domèn PFYRE (S474L) te modifye aktivite transkripsyon RGA san li pa afekte kapasite li pou kominike avèk patnè faktè transkripsyon50. Malgre ke mitasyon sa a trè pre ak 3 sibstitisyon asid amine ki prezan nan mRGA, etid nou yo montre ke de mitasyon sa yo modifye karakteristik diferan DELLA. Malgre ke pifò patnè faktè transkripsyon mare ak domèn LHR1 ak SAW DELLA26,51, kèk asid amine konsève nan domèn PFYRE a ka ede estabilize entèraksyon sa yo.
Devlopman internod se yon karakteristik kle nan achitekti plant ak amelyorasyon sede. qmRGA te revele yon pi gwo aktivite siyalizasyon GA nan selil pwogéniteur internod IPR yo. Lè nou konbine imaj kantitatif ak jenetik, nou te montre ke modèl siyalizasyon GA yo sipèpoze plan divizyon selilè sikilè/transvès nan epidèm SAM lan, sa ki fòme òganizasyon divizyon selilè ki nesesè pou devlopman internod. Plizyè regilatè oryantasyon plan divizyon selilè yo te idantifye pandan devlopman52,53. Travay nou an bay yon egzanp klè sou kijan aktivite siyalizasyon GA a kontwole paramèt selilè sa a. DELLA ka kominike avèk konplèks pwoteyin pre-pliye41, kidonk siyalizasyon GA a ka kontwole oryantasyon plan divizyon selilè a lè li enfliyanse dirèkteman oryantasyon mikrotubil kortikal40,41,54,55. Nou te montre sanzatann ke nan SAM, korelasyon aktivite siyalizasyon GA ki pi wo a pa t elongasyon oswa divizyon selilè, men sèlman anizotropi kwasans, ki konsistan avèk yon efè dirèk GA sou direksyon divizyon selilè nan IPR a. Sepandan, nou pa ka eskli ke efè sa a ta ka endirèk tou, pa egzanp medyatè pa ramolisman miray selilè pwovoke pa GA56. Chanjman nan pwopriyete miray selilè yo pwovoke estrès mekanik57,58, ki kapab enfliyanse tou oryantasyon plan divizyon selilè a lè li afekte oryantasyon mikrotubil kortikal yo39,46,59. Efè konbine estrès mekanik pwovoke pa GA ak règleman dirèk oryantasyon mikrotubil pa GA ka enplike nan jenerasyon yon modèl espesifik oryantasyon divizyon selilè nan IPR a pou defini internouds yo, epi plis etid nesesè pou teste lide sa a. Menm jan an tou, etid anvan yo te mete aksan sou enpòtans pwoteyin TCP14 ak 15 ki kominike avèk DELLA nan kontwòl fòmasyon internoud60,61 epi faktè sa yo ka medyatè aksyon GA ansanm ak BREVIPEDICELLUS (BP) ak PENNYWISE (PNY), ki kontwole devlopman internoud epi yo te montre yo enfliyanse siyalizasyon GA2,62. Etandone DELLA yo kominike avèk chemen siyalizasyon brassinosteroid, etilèn, asid jasmonik, ak asid absisik (ABA)63,64 epi òmòn sa yo ka enfliyanse oryantasyon mikrotubil yo65, efè GA sou oryantasyon divizyon selilè yo ka medyatè tou pa lòt òmòn.
Premye etid sitolojik yo te montre ke tou de rejyon entèn ak ekstèn SAM Arabidopsis yo nesesè pou devlopman internoud yo2,42. Lefèt ke GA kontwole aktivman divizyon selilè nan tisi entèn yo12 sipòte yon doub fonksyon GA nan reglemante gwosè meristèm ak internoud nan SAM la. Modèl divizyon selilè direksyonèl la reglemante tou byen sere nan tisi SAM entèn lan, e règleman sa a esansyèl pou kwasans tij52. Li pral enteresan pou egzamine si GA jwe tou yon wòl nan oryante plan divizyon selilè a nan òganizasyon SAM entèn lan, kidonk senkronize spesifikasyon ak devlopman internoud yo nan SAM la.
Plant yo te grandi in vitro nan tè oubyen nan mwayen 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) complété ak 1% sikwoz ak 1% agar (Sigma) nan kondisyon estanda (16 èdtan limyè, 22 °C), eksepte pou eksperyans kwasans ipokotil ak rasin kote plantules yo te grandi sou plak vètikal anba limyè konstan ak 22 °C. Pou eksperyans nitrat yo, plant yo te grandi sou mwayen MS modifye (medyòm plant bioWORLD) complété ak nitrat adekwa (0 oubyen 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-siksinat, 1% sikwoz ak 1% A-agar (Sigma) nan kondisyon jounen long.
ADNc GID1a ki te mete nan pDONR221 te rekonbine avèk pDONR P4-P1R-pUBQ10 ak pDONR P2R-P3-mCherry nan pB7m34GW pou jenere pUBQ10::GID1a-mCherry. ADN IDD2 ki te mete nan pDONR221 te rekonbine nan pB7RWG266 pou jenere p35S:IDD2-RFP. Pou jenere pGID1b::2xmTQ2-GID1b, yo te premye anplifye yon fragman 3.9 kb an amont rejyon kodaj GID1b la ak yon fragman 4.7 kb ki gen ADNc GID1b la (1.3 kb) ak terminatè a (3.4 kb) lè l sèvi avèk primè ki nan Tablo Siplemantè 3 epi answit yo te mete yo nan pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) ak pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), respektivman, epi finalman yo te rekombine ak pDONR221 2xmTQ268 nan vektè sib pGreen 012567 la lè l sèvi avèk klonaj Gateway. Pou jenere pCUC2::LSSmOrange, sekans pwomotè CUC2 a (3229 bp an amont ATG) ki te swiv pa sekans kodaj gwo Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange)69 la ak siyal lokalizasyon nikleyè N7 la ak terminateur transkripsyon NOS la te rasanble nan vektè sib pGreen kanamycin lan lè l sèvi avèk sistèm rekombinasyon 3-fragman Gateway (Invitrogen). Vektè binè plant lan te entwodui nan souch Agrobacterium tumefaciens GV3101 epi entwodui nan fèy Nicotiana benthamiana pa metòd enfiltrasyon Agrobacterium ak nan Arabidopsis thaliana Col-0 pa metòd tranpe floral, respektivman. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry ak pCLV3::mCherry-NLS qmRGA te izole nan pitit F3 ak F1 kwaze respektif yo, respektivman.
Yo te fè ibridasyon ARN in situ sou pwent tij ki te apeprè 1 cm longè72, yo te kolekte yo epi fikse yo imedyatman nan yon solisyon FAA (3.7% fòmaldeyid, 5% asid asetik, 50% etanòl) ki te refwadi alavans a 4 °C. Apre 2 tretman vakyòm pandan 15 minit, yo te chanje fiksatif la epi yo te enkube echantiyon yo pandan tout lannwit lan. Yo te sentetize ADNc GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, ak RGL3 ansanm ak sond antisans pou 3'-UTR yo lè l sèvi avèk primè yo montre nan Tablo Siplemantè 3 jan Rosier et al.73 dekri sa. Yo te imunodetekte sond ki make ak digoksijenin yo lè l sèvi avèk antikò digoksijenin (dilisyon 3000 fwa; Roche, nimewo katalòg: 11 093 274 910), epi yo te kolore seksyon yo ak solisyon 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP, dilisyon 250 fwa)/nitroblue tetrazolium (NBT, dilisyon 200 fwa).
Dat piblikasyon: 10 Fevriye 2025