Tire apical meristem (SAM) kwasans se kritik pou achitekti tij. Plant òmòngiberelin(GAs) jwe wòl kle nan kowòdone kwasans plant, men wòl yo nan SAM a rete mal konprann. Isit la, nou devlope yon byodetèktè rasyonometrik nan siyal GA nan jeni pwoteyin DELLA a pou siprime fonksyon regilasyon esansyèl li nan repons transkripsyon GA pandan y ap konsève degradasyon li sou rekonesans GA. Nou demontre ke biocapteur sa a ki baze sou degradasyon anrejistre avèk presizyon chanjman nan nivo GA ak deteksyon selilè pandan devlopman. Nou itilize biosensor sa a pou kat aktivite siyal GA nan SAM la. Nou montre ke siyal GA segondè yo prezan sitou nan selil ki sitiye ant primordi ògàn, ki se précurseur nan selil internode. Sèvi ak apwòch genyen ak pèt-of-fonksyon, nou plis demontre ke GA kontwole oryantasyon an nan avyon an divizyon selilè, etabli òganizasyon an selilè kanonik nan internodes, kidonk ankouraje spesifikasyon internode nan SAM la.
Tire apikal meristem (SAM), ki chita nan apex lans, gen yon nich nan selil souch ki gen aktivite jenere ògàn lateral ak nœuds tij nan yon fason modilè ak iteratif pandan tout lavi plant la. Chak nan inite repete sa yo, oswa nœuds plant yo, gen ladan nœuds ak ògàn lateral nan nœuds yo, ak meristem aksilè nan aksil fèy yo1. Kwasans ak òganizasyon nœuds plant yo chanje pandan devlopman. Nan Arabidopsis, kwasans internodal siprime pandan etap vejetatif la, ak meristem axillary rete andòmi nan aksil fèy rozèt yo. Pandan tranzisyon an nan faz flè a, SAM la vin meristem enfloresans la, jenere internodes long ak ti boujon axillary, branchlets nan aksil yo nan fèy cauline, epi pita, flè san fèy2. Malgre ke nou te fè pwogrè siyifikatif nan konpreyansyon mekanis yo ki kontwole inisyasyon nan fèy, flè, ak branch, relativman ti kras yo konnen sou ki jan internodes leve.
Konprann distribisyon espas tanporèl GA yo pral ede pi byen konprann fonksyon òmòn sa yo nan diferan tisi ak nan diferan etap devlopman. Vizyalizasyon degradasyon fizyon RGA-GFP ki eksprime anba aksyon pwomotè pwòp li yo bay enfòmasyon enpòtan sou règleman nivo total GA nan rasin15,16. Sepandan, ekspresyon RGA varye atravè tisi17 epi li reglemante pa GA18. Kidonk, ekspresyon diferans nan pwomotè RGA a ka lakòz modèl fluoresans obsève ak RGA-GFP e konsa metòd sa a pa quantitative. Plis dènyèman, bioaktif fluorescein (Fl) ki make GA19,20 devwale akimilasyon GA nan andokortex rasin lan ak règleman an nan nivo selilè li yo pa transpò GA. Dènyèman, Capteur GA FRET nlsGPS1 te montre ke nivo GA korelasyon ak elongasyon selilè nan rasin, filaman, ak ipokotil ki grandi nan nwa21. Sepandan, jan nou te wè, konsantrasyon GA se pa sèlman paramèt ki kontwole aktivite siyal GA, paske li depann de pwosesis deteksyon konplèks. Isit la, sou baz konpreyansyon nou sou DELLA ak chemen siyal GA yo, nou rapòte devlopman ak karakterizasyon yon byodetèktè rasyonometrik ki baze sou degradasyon pou siyal GA. Pou devlope biosensor quantitative sa a, nou te itilize yon mutan GA-sansib RGA ki te kole ak yon pwoteyin fliyoresan ak omniprésente eksprime nan tisi, osi byen ke yon pwoteyin fliyoresan GA-ensansib. Nou montre ke fizyon pwoteyin RGA mutan yo pa entèfere ak siyal GA andojèn lè yo eksprime omniprésente, e ke biosensor sa a ka quantifier aktivite siyal ki soti nan tou de D 'GA ak pwosesis siyal GA pa aparèy deteksyon an ak rezolisyon spatiotemporal segondè. Nou itilize biosensor sa a pou kat distribisyon espas-temporal aktivite siyal GA ak quantifier ki jan GA kontwole konpòtman selilè nan epidèm SAM la. Nou demontre ke GA kontwole oryantasyon plan divizyon selil SAM ki sitiye ant primordi ògàn yo, kidonk defini òganizasyon selilè kanonik internode la.
Finalman, nou te mande si qmRGA te kapab rapòte chanjman nan nivo GA andojèn lè l sèvi avèk ipokotil k ap grandi. Nou te deja montre ke nitrat stimul kwasans lè yo ogmante sentèz GA ak, nan vire, degradasyon DELLA34. An konsekans, nou te obsève ke longè ipokotil nan plant pUBQ10::qmRGA grandi anba rezèv nitrat abondan (10 mM NO3-) te siyifikativman pi long pase sa nan plant grandi nan kondisyon nitrat-ensufizant (figi siplemantè 6a). Konfòm ak repons kwasans lan, siyal GA yo te pi wo nan ipokotil plant yo grandi anba kondisyon 10 mM NO3- pase nan plant yo grandi nan absans nitrat (figi siplemantè 6b, c). Kidonk, qmRGA tou pèmèt siveyans chanjman nan siyal GA pwovoke pa chanjman andojèn nan konsantrasyon GA.
Pou konprann si aktivite siyal GA detekte pa qmRGA depann de konsantrasyon GA ak pèsepsyon GA, jan yo espere ki baze sou konsepsyon Capteur a, nou analize ekspresyon twa reseptè GID1 yo nan tisi vejetatif ak repwodiktif. Nan plant, liy repòtè GID1-GUS la te montre ke GID1a ak c yo te eksprime anpil nan kotiledon (figi 3a-c). Anplis de sa, tout twa reseptè yo te eksprime nan fèy, primordi rasin lateral, konsèy rasin (eksepte pou bouchon rasin GID1b), ak sistèm vaskilè a (figi 3a-c). Nan enfloresans SAM a, nou detekte siyal GUS sèlman pou GID1b ak 1c (figi siplemantè 7a-c). Ibridizasyon in situ konfime modèl ekspresyon sa yo e li te demontre plis ke GID1c te eksprime yon fason ki ba nan nivo SAM a, tandiske GID1b te montre pi wo ekspresyon nan periferik SAM la (figi siplemantè 7d-l). Fizyon tradiksyon pGID1b::2xmTQ2-GID1b la te revele tou yon seri gradye nan ekspresyon GID1b, ki soti nan ekspresyon ki ba oswa ki pa gen nan sant SAM a nan ekspresyon segondè nan fwontyè ògàn yo (figi siplemantè 7m). Kidonk, reseptè GID1 yo pa inifòm distribye atravè ak nan tisi yo. Nan eksperyans ki vin apre yo, nou menm tou nou te obsève ke twòp ekspresyon nan GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) ogmante sansiblite nan qmRGA nan ipokotil nan aplikasyon ekstèn GA (Fig. 3d, e). Kontrèman, fliyoresans mezire pa qd17mRGA nan ipokotil la te ensansib nan tretman GA3 (figi 3f, g). Pou tou de tès yo, plant yo te trete ak gwo konsantrasyon nan GA (100 μM GA3) pou evalye konpòtman an rapid nan Capteur a, kote kapasite nan mare nan reseptè GID1 la te amelyore oswa pèdi. Ansanm, rezilta sa yo konfime ke biosensor qmRGA a sèvi yon fonksyon konbine kòm yon Capteur GA ak GA, epi sijere ke ekspresyon diferans nan reseptè GID1 a ka siyifikativman modil emisivite nan Capteur a.
Pou dat, distribisyon an nan siyal GA nan SAM a rete klè. Se poutèt sa, nou te itilize plant ki eksprime qmRGA ak rapò selil souch pCLV3::mCherry-NLS35 pou kalkile kat jeyografik quantitative wo rezolisyon nan aktivite siyal GA, konsantre sou kouch L1 (epiderm; Fig. 4a, b, gade Metòd ak metòd siplemantè), depi L13 jwe wòl kle nan kwasans SAM. Isit la, ekspresyon pCLV3::mCherry-NLS bay yon pwen referans fiks jeyometrik pou analize distribisyon espas-temporal aktivite siyal GA37. Malgre ke GA konsidere kòm esansyèl pou devlopman ògàn lateral4, nou te obsève ke siyal GA yo te ba nan primòd floral (P) kòmanse nan etap P3 la (figi 4a, b), tandiske jèn primòd P1 ak P2 te gen aktivite modere menm jan ak sa ki nan rejyon santral la (figi 4a, b). Pi wo aktivite siyal GA yo te detekte nan fwontyè primòd ògàn yo, kòmanse nan P1 / P2 (nan kote fwontyè a) ak pik nan P4, osi byen ke nan tout selil nan rejyon an periferik ki sitiye ant primordi yo (Fig. 4a, b ak Fig. Siplemantè 8a, b). Aktivite siyal GA ki pi wo sa a te obsève pa sèlman nan epidèm la, men tou nan kouch L2 ak anwo L3 (figi siplemantè 8b). Modèl siyal GA yo detekte nan SAM lè l sèvi avèk qmRGA tou te rete san chanjman sou tan (Siplemantè Fig. 8c-f, k). Malgre ke konstriksyon qd17mRGA a te sistematik downregulated nan SAM nan plant T3 soti nan senk liy endepandan ke nou karakterize an detay, nou te kapab analize modèl yo fliyoresan jwenn ak pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP konstwi (Siplemantè Fig. 8g-j, l). Nan liy kontwòl sa a, se sèlman ti chanjman nan rapò fliyoresans yo te detekte nan SAM a, men nan sant SAM nou te obsève yon diminisyon klè ak inatandi nan VENUS ki asosye ak TagBFP. Sa a konfime ke modèl siyal la obsève pa qmRGA reflete degradasyon GA-depandan nan mRGA-VENUS, men tou, demontre ke qmRGA ka surestimate aktivite siyal GA nan sant la meristem. An rezime, rezilta nou yo revele yon modèl siyal GA ki prensipalman reflete distribisyon primordia yo. Distribisyon sa a nan rejyon an entè-primordial (IPR) se akòz etablisman an gradyèl nan gwo aktivite siyal GA ant primòd la devlope ak rejyon santral la, pandan y ap an menm tan an aktivite siyal GA nan primòd la diminye (figi 4c, d).
Distribisyon reseptè GID1b ak GID1c (gade pi wo a) sijere ke ekspresyon diferans nan reseptè GA ede fòme modèl aktivite siyal GA nan SAM la. Nou te mande si akimilasyon diferans nan GA ta ka enplike. Pou mennen ankèt sou posibilite sa a, nou itilize nlsGPS1 GA FRET sensor21. Ogmantasyon frekans aktivasyon te detekte nan SAM nan nlsGPS1 trete ak 10 μM GA4 + 7 pou 100 min (figi siplemantè 9a-e), ki endike ke nlsGPS1 reponn a chanjman nan konsantrasyon GA nan SAM a, menm jan li fè sa nan rasin21. Distribisyon espasyal nan frekans aktivasyon nlsGPS1 revele nivo GA relativman ba nan kouch ekstèn SAM a, men yo te montre ke yo te elve nan sant la ak nan fwontyè SAM la (Fig. 4e ak Fig. Siplemantè 9a, c). Sa a sijere ke GA distribye tou nan SAM a ak yon modèl espasyal ki konparab ak sa ki revele pa qmRGA. Kòm yon apwòch konplemantè, nou menm tou nou trete SAM a ak GA fliyoresan (GA3-, GA4-, GA7-Fl) oswa Fl pou kont li kòm yon kontwòl negatif. Siyal Fl la te distribye nan tout SAM a, ki gen ladan rejyon santral la ak primòd, kwake nan yon entansite pi ba (figi 4j ak Figi siplemantè 10d). Kontrèman, tout twa GA-Fl akimile espesyalman nan fwontyè primòd yo ak divès degre nan rès IPR a, ak GA7-Fl akimile nan domèn nan pi gwo nan IPR a (figi 4k ak Figi siplemantè 10a, b). Kantifikasyon entansite fluoresans revele ke rapò entansite IPR a ki pa IPR te pi wo nan SAM trete GA-Fl konpare ak SAM trete FL (figi 4l ak Figi siplemantè 10c). Ansanm, rezilta sa yo sijere ke GA prezan nan pi gwo konsantrasyon nan selil IPR ki pi pre fwontyè ògàn yo. Sa a sijere ke modèl aktivite siyal SAM GA rezilta nan tou de ekspresyon diferans nan reseptè GA ak akimilasyon diferans nan GA nan selil IPR toupre fwontyè ògàn yo. Kidonk, analiz nou an te revele yon modèl spatiotemporal inatandi nan siyal GA, ak aktivite pi ba nan sant la ak primòd nan SAM a ak aktivite ki pi wo nan IPR a nan rejyon an periferik.
Pou konprann wòl aktivite siyal diferans GA nan SAM a, nou analize korelasyon ki genyen ant aktivite siyal GA, ekspansyon selilè, ak divizyon selilè lè l sèvi avèk imaj tan reyèl nan tan reyèl nan SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS la. Bay wòl GA nan règleman kwasans, yo te espere yon korelasyon pozitif ak paramèt ekspansyon selil yo. Se poutèt sa, nou te premye konpare kat aktivite siyal GA ak kat jeyografik pousantaj kwasans sifas selil yo (kòm yon prokurasyon pou fòs ekspansyon selilè pou yon selil bay yo ak pou selil pitit fi yo nan divizyon) ak kat nan anisotropi kwasans, ki mezire direksyon ekspansyon selilè (yo itilize tou isit la pou yon selil bay yo ak pou selil pitit fi nan divizyon; Fig. 5a, b, gade Metòd siplemantè). Kat nou yo nan pousantaj kwasans sifas selil SAM yo ki konsistan avèk obsèvasyon anvan yo38,39, ak to kwasans minimòm nan fwontyè a ak to kwasans maksimòm nan devlope flè (Fig. 5a). Analiz prensipal eleman (PCA) te montre ke aktivite siyal GA te negatif korelasyon ak entansite kwasans sifas selil (Figi 5c). Nou te montre tou ke aks prensipal yo nan varyasyon, ki gen ladan opinyon siyal GA ak entansite kwasans, yo te orthogonal nan direksyon ki detèmine pa ekspresyon CLV3 segondè, ki konfime esklizyon selil ki soti nan sant la SAM nan analiz ki rete yo. Analiz korelasyon Spearman te konfime rezilta PCA yo (Figi 5d), ki endike ke pi wo siyal GA nan IPR a pa t lakòz pi wo ekspansyon selilè. Sepandan, analiz korelasyon revele yon ti tay korelasyon pozitif ant aktivite siyal GA ak anisotropi kwasans (Figi 5c, d), sijere ke pi wo siyal GA nan IPR a enfliyanse direksyon kwasans selil ak pètèt pozisyon nan avyon an divizyon selilè.
a, b Kat chalè mwayèn kwasans sifas (a) ak anisotropi kwasans (b) nan SAM mwayèn sou sèt plant endepandan (itilize kòm proxy pou fòs ak direksyon ekspansyon selilè, respektivman). c Analiz PCA enkli varyab sa yo: siyal GA, entansite kwasans sifas, anisotropi kwasans sifas, ak ekspresyon CLV3. Eleman PCA 1 te sitou negatif korelasyon ak entansite kwasans sifas ak pozitivman korelasyon ak siyal GA. Eleman PCA 2 te sitou pozitivman korelasyon ak anisotropi kwasans sifas ak negatif korelasyon ak ekspresyon CLV3. Pousantaj reprezante varyasyon chak eleman eksplike. d Analiz korelasyon Spearman ant siyal GA, entansite kwasans sifas, ak anisotropi kwasans sifas nan echèl tisi eksepte CZ. Nimewo sou bò dwat la se valè Spearman rho ant de varyab. Asteris yo endike ka kote korelasyon / korelasyon negatif la trè enpòtan. e Vizyalizasyon 3D nan selil Col-0 SAM L1 pa mikwoskopi konfokal. Nouvo mi selil ki fòme nan SAM a (men se pa primòd la) nan 10 h gen koulè selon valè ang yo. Yo montre ba koulè a nan kwen ki pi ba dwat. Ankadreman an montre imaj 3D ki koresponn lan a 0 h. Eksperyans lan te repete de fwa ak rezilta menm jan an. f Bwat yo montre pousantaj divizyon selilè nan IPR ak ki pa IPR Col-0 SAM (n = 10 plant endepandan). Liy santral la montre medyàn lan, epi limit bwat yo endike 25yèm ak 75yèm percentile yo. Moustach yo endike valè minimòm ak maksimòm yo detèmine ak lojisyèl R. Valè P yo te jwenn ak tès t de Welch la. g, h Dyagram chema ki montre (g) kijan pou mezire ang nouvo miray selil la (magenta) parapò ak direksyon radial soti nan sant SAM (liy pwentiye blan) (sèlman valè ang egi, sa vle di, 0–90°, yo konsidere), epi (h) direksyon sikonferansyal/lateral ak radial nan meristem la. i Istogram frekans oryantasyon plan divizyon selilè atravè SAM (ble fonse), IPR (ble mwayen), ak ki pa IPR (ble limyè), respektivman. Valè P yo te jwenn pa yon tès Kolmogorov-Smirnov de-ke. Eksperyans lan te repete de fwa ak rezilta menm jan an. j Istogram frekans oryantasyon plan divizyon selilè IPR alantou P3 (vèt klè), P4 (vèt mwayen), ak P5 (vèt fonse), respektivman. Valè P yo te jwenn pa yon tès Kolmogorov-Smirnov de-ke. Eksperyans lan te repete de fwa ak rezilta menm jan an.
Se poutèt sa, nou pwochen envestige korelasyon ki genyen ant siyal GA ak aktivite divizyon selilè lè nou idantifye mi selil ki fèk fòme pandan tès la (Fig. 5e). Apwòch sa a te pèmèt nou mezire frekans ak direksyon divizyon selilè. Surprenante, nou te jwenn ke frekans nan divizyon selilè nan IPR a ak rès la nan SAM la (ki pa IPR, Fig. 5f) te menm jan an, ki endike ke diferans ki genyen nan siyal GA ant selil IPR ak ki pa IPR pa siyifikativman afekte divizyon selilè. Sa a, ak korelasyon pozitif ant siyal GA ak anisotropi kwasans, te pouse nou konsidere si aktivite siyal GA ta ka enfliyanse oryantasyon avyon divizyon selilè a. Nou mezire oryantasyon nouvo miray selil la kòm yon ang egi parapò ak aks radial ki konekte sant meristem ak sant nouvo miray selil la (figi 5e-i) epi nou te obsève yon tandans klè pou selil yo divize nan ang ki toupre 90° parapò ak aks radial la, ak frekans ki pi wo yo obsève nan 70–80–28 % (230–28 %) (2 80–28 %) (Fig. 5e, i), ki koresponn ak divizyon selilè nan direksyon sikonferans / transverse (Fig. 5h). Pou egzamine kontribisyon siyal GA nan konpòtman divizyon selilè sa a, nou analize paramèt divizyon selilè nan IPR ak ki pa IPR separeman (figi 5i). Nou te obsève ke distribisyon an ang divizyon nan selil IPR diferan de sa ki nan selil ki pa IPR oswa nan selil nan SAM a tout antye, ak selil IPR montre yon pwopòsyon ki pi wo nan divizyon selil lateral / sikilè, sa vle di, 70-80 ° ak 80-90 ° (33.86% ak 30.71%, respektivman, pwopòsyon korespondan Fig. 5i). Kidonk, obsèvasyon nou yo te revele yon asosyasyon ant gwo siyal GA ak yon oryantasyon avyon divizyon selilè fèmen nan direksyon sikonferansyal la, menm jan ak korelasyon ki genyen ant aktivite siyal GA ak anisotropi kwasans (Fig. 5c, d). Pou plis etabli konsèvasyon espasyal nan asosyasyon sa a, nou mezire oryantasyon avyon divizyon an nan selil IPR ki antoure primòd la kòmanse soti nan P3, depi pi gwo aktivite siyal GA yo te detekte nan rejyon sa a kòmanse soti nan P4 (Fig. 4). Ang divizyon IPR a alantou P3 ak P4 pa te montre okenn diferans estatistik enpòtan, byenke yon frekans ogmante nan divizyon selil lateral yo te obsève nan IPR alantou P4 (figi 5j). Sepandan, nan selil IPR yo alantou P5, diferans lan nan oryantasyon nan avyon an divizyon selilè te vin estatistik enpòtan, ak yon ogmantasyon byen file nan frekans nan divizyon selil transverse (figi 5j). Ansanm, rezilta sa yo sijere ke siyal GA ka kontwole oryantasyon divizyon selilè nan SAM a, ki konsistan avèk rapò anvan yo40,41 ke siyal GA segondè ka pwovoke oryantasyon lateral divizyon selilè nan IPR la.
Yo prevwa ke selil nan IPR a pa pral enkòpore nan primordia men pito nan internodes2,42,43. Oryantasyon transverse divizyon selil yo nan IPR a ka lakòz òganizasyon tipik nan ranje paralèl longitudinal nan selil epidèm nan internodes. Obsèvasyon nou yo ki dekri pi wo a sijere ke siyal GA gen anpil chans jwe yon wòl nan pwosesis sa a pa reglemante direksyon divizyon selilè.
Pèt fonksyon plizyè jèn DELLA lakòz yon repons konstititif GA, epi mutants della ka itilize pou teste ipotèz sa a44. Nou te premye analize modèl ekspresyon senk jèn DELLA nan SAM la. Fizyon transkripsyon liy GUS45 la te revele ke GAI, RGA, RGL1, ak RGL2 (nan yon limit pi piti) yo te eksprime nan SAM la (figi siplemantè 11a–d). In situ ibridizasyon plis demontre ke GAI mRNA akimile espesyalman nan primordia ak devlope flè (Siplemantè Fig. 11e). RGL1 ak RGL3 mRNA yo te detekte nan tout canopy SAM a ak nan flè ki pi gran, tandiske RGL2 mRNA te pi abondan nan rejyon fwontyè a (Siplemantè Figi 11f-h). D 'konfokal nan pRGL3::RGL3-GFP SAM konfime ekspresyon an obsève pa ibridasyon in situ epi li te montre ke pwoteyin RGL3 akimile nan pati santral la nan SAM la (figi siplemantè 11i). Sèvi ak liy pRGA::GFP-RGA a, nou jwenn tou ke pwoteyin RGA akimile nan SAM a, men abondans li yo diminye nan fwontyè a kòmanse nan P4 (figi siplemantè 11j). Miyò, modèl ekspresyon RGL3 ak RGA yo konsistan avèk aktivite siyal GA ki pi wo nan IPR a, jan qmRGA detekte (figi 4). Anplis, done sa yo endike ke tout DELLA yo eksprime nan SAM la epi ekspresyon yo kolektivman kouvri tout SAM la.
Apre sa, nou analize paramèt divizyon selilè yo nan SAM nan kalite sovaj (Ler, kontwòl) ak gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutan (figi 6a, b). Enteresan, nou te obsève yon chanjman estatistik siyifikatif nan distribisyon an nan frekans ang divizyon selilè nan della global mutant SAM konpare ak kalite a sovaj (Fig. 6c). Chanjman sa a nan mutant global della della te akòz yon ogmantasyon nan frekans 80-90 ° ang (34.71% vs 24.55%) ak, nan yon pi piti limit, 70-80 ° ang (23.78% vs 20.18%), sa vle di, ki koresponn ak divizyon selil transverse (figi 6c). Frekans nan divizyon ki pa transverse (0-60 °) te tou pi ba nan mutant global la (Fig. 6c). Te frekans nan divizyon selil transverse siyifikativman ogmante nan SAM nan mutant global la (figi 6b). Frekans nan divizyon selil transverse nan IPR a te tou pi wo nan mutant global la konpare ak kalite sovaj la (figi 6d). Deyò rejyon IPR a, kalite sovaj la te gen yon distribisyon plis inifòm nan ang divizyon selilè, tandiske mutan mondyal la te prefere divizyon tanjansyèl tankou IPR (figi 6e). Nou menm tou nou mezire oryantasyon divizyon selil yo nan SAM nan mutan quintiple ga2 oksidaz (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, ak ga2ox6-2), yon background mutan GA-inaktif kote GA akimile. Konfòm ak ogmantasyon nan nivo GA, SAM nan enfloresans mutant quintiple ga2ox la te pi gwo pase sa yo ki nan Col-0 (figi siplemantè 12a, b), epi konpare ak Col-0, quintiple ga2ox SAM la te montre yon distribisyon diferan nan ang divizyon selilè, ak frekans ang la ogmante soti nan 50 °, divizyon tanjansyèl ankò. Figi 12a–c). Kidonk, nou montre ke aktivasyon konstititif nan siyal GA ak akimilasyon GA pwovoke divizyon selil lateral nan IPR a ak rès SAM la.
a, b vizyalizasyon 3D nan kouch nan L1 nan PI-tache Ler (a) ak global della mutant (b) SAM lè l sèvi avèk mikwoskòp konfokal. Nouvo mi selil ki fòme nan SAM a (men se pa primòd la) sou yon peryòd 10-h yo montre ak koulè selon valè ang yo. Ankadreman an montre SAM a nan 0 h. Ba koulè a parèt nan kwen ki pi ba dwat. Flèch ki nan (b) lonje dwèt sou yon egzanp dosye selil ki aliyen nan global della mutant la. Eksperyans lan te repete de fwa ak rezilta menm jan an. ce konparezon nan distribisyon an frekans nan oryantasyon avyon divizyon selilè nan tout SAM (d), IPR (e), ak ki pa IPR (f) ant Ler ak global della. Valè P yo te jwenn lè l sèvi avèk yon tès Kolmogorov-Smirnov de-ke. f, g vizyalizasyon 3D nan imaj konfokal nan PI-tache SAM nan Col-0 (i) ak pCUC2::gai-1-VENUS (j) plant transjenik. Panno (a, b) montre nouvo mi selil yo (men se pa primordia) ki fòme nan SAM la nan 10 èdtan. Eksperyans lan te repete de fwa ak rezilta menm jan an. h–j Konparezon distribisyon frekans nan oryantasyon avyon divizyon selilè ki sitiye nan tout plant SAM (h), IPR (i) ak ki pa IPR (j) ant Col-0 ak pCUC2::gai-1-VENUS plant yo. Valè P yo te jwenn lè l sèvi avèk yon tès Kolmogorov-Smirnov de-ke.
Nou te teste pwochen efè a nan anpeche siyal GA espesyalman nan IPR la. Pou sa ka fèt, nou te itilize pwomotè cotyledon cup 2 (CUC2) pou kondwi ekspresyon de yon pwoteyin gai-1 negatif dominan ki kole ak VENUS (nan liy pCUC2::gai-1-VENUS). Nan SAM nan kalite sovaj, pwomotè CUC2 kondwi ekspresyon nan pifò IPR nan SAM a, ki gen ladan selil fwontyè, soti nan P4 ivè, ak ekspresyon espesifik menm jan an te obsève nan plant pCUC2::gai-1-VENUS (gade anba a). Distribisyon ang selil divizyon atravè SAM oswa IPR nan plant pCUC2::gai-1-VENUS pa t 'siyifikativman diferan de sa ki nan kalite sovaj la, byenke san atann nou te jwenn ke selil san yo pa yon IPR nan plant sa yo divize nan yon frekans ki pi wo nan 80-90 ° (Fig. 6f-j).
Li te sigjere ke direksyon divizyon selilè depann de jeyometri SAM a, an patikilye estrès rupture ki te pwodwi pa koub tisi a46. Se poutèt sa, nou te mande si fòm SAM a te chanje nan plant della mutant mondyal la ak pCUC2::gai-1-VENUS. Jan nou te rapòte deja12, gwosè SAM mutant della mondyal la te pi gwo pase kalite sovaj (figi siplemantè 13a, b, d). Ibridizasyon nan situ CLV3 ak STM RNA konfime ekspansyon meristem nan della mutants ak plis montre ekspansyon lateral nich selil souch la (figi siplemantè 13e, f, h, i). Sepandan, koub SAM a te menm jan an nan tou de jenotip (figi siplemantè 13k, m, n, p). Nou te obsève yon ogmantasyon menm jan an nan gwosè nan gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant san yon chanjman nan koub konpare ak kalite sovaj la (Siplemantè Figi 13c, d, g, j, l, o, p). Frekans oryantasyon divizyon selilè a te afekte tou nan mutan della quadruple, men nan yon pi piti limit pase nan mutan monolitik della (figi siplemantè 12d-f). Efè dòz sa a, ansanm ak mank de yon efè sou koub, sijere ke aktivite RGL3 rezidyèl nan Della quadruple mutant limite chanjman nan oryantasyon divizyon selilè ki te koze pa pèt nan aktivite DELLA ak ke chanjman nan divizyon selil lateral rive an repons a chanjman nan aktivite siyal GA olye ke chanjman nan jeyometri SAM. Jan sa dekri pi wo a, pwomotè CUC2 kondwi ekspresyon IPR nan SAM a kòmanse nan P4 (figi siplemantè 14a, b), ak nan kontras, pCUC2:: gai-1-VENUS SAM a te gen yon gwosè redwi men pi wo koub (figi siplemantè 14c-h). Chanjman sa a nan mòfoloji pCUC2::gai-1-VENUS SAM ka lakòz yon distribisyon diferan nan estrès mekanik konpare ak kalite a sovaj, nan ki gwo estrès sikonferansyèl kòmanse nan yon distans ki pi kout nan sant SAM la. Altènativman, chanjman ki fèt nan pCUC2::gai-1-VENUS SAM mòfoloji ka soti nan chanjman nan pwopriyete mekanik rejyonal pwovoke pa ekspresyon transgene48. Nan de ka yo, sa a ka pasyèlman konpanse efè chanjman nan siyal GA lè yo ogmante chans pou selil yo divize nan oryantasyon sikonferansyal / transverse, ki eksplike obsèvasyon nou yo.
Ansanm, done nou yo konfime ke pi wo siyal GA jwe yon wòl aktif nan oryantasyon lateral plan divizyon selilè nan IPR la. Yo montre tou ke koub meristem tou enfliyanse oryantasyon an nan avyon an divizyon selilè nan IPR la.
Oryantasyon transvèsal plan divizyon an nan IPR a, akòz gwo aktivite siyal GA, sijere ke GA pre-òganize yon dosye selil radial nan epidèm nan nan SAM la defini òganizasyon selilè ki pral pita jwenn nan internode epidèm la. Vreman vre, dosye selil sa yo te souvan vizib nan imaj SAM nan mutan global della (Fig. 6b). Se konsa, plis eksplore fonksyon devlopman nan modèl la espasyal nan siyal GA nan SAM a, nou te itilize D 'time-lapse analize òganizasyon an espasyal nan selil nan IPR a nan kalite sovaj (Ler ak Col-0), della mutan mondyal, ak pCUC2::gai-1-VENUS plant transjenik.
Nou te jwenn ke qmRGA te montre ke aktivite siyal GA nan IPR a te ogmante soti nan P1 / P2 ak pik nan P4, ak modèl sa a rete konstan sou tan (figi 4a-f ak Figi siplemantè 8c-f, k). Pou analize òganizasyon espasyal selil yo nan IPR a ak ogmante siyal GA, nou make selil Ler IPR pi wo a ak sou kote yo nan P4 dapre sò devlopman yo analize 34 èdtan apre premye obsèvasyon, sa vle di, plis pase de fwa plastid, ki pèmèt nou swiv selil IPR pandan devlopman primòd ki soti nan P1/P2 rive nan P4. Nou te itilize twa koulè diferan: jòn pou selil sa yo ki te entegre nan primòd la toupre P4, vèt pou moun ki te nan IPR a, ak koulè wouj violèt pou moun ki te patisipe nan tou de pwosesis (Fig. 7a–c). Nan t0 (0 h), 1-2 kouch selil IPR yo te vizib devan P4 (figi 7a). Kòm espere, lè selil sa yo divize, yo te fè sa sitou atravè plan divizyon transverse a (figi 7a–c). Rezilta menm jan an te jwenn lè l sèvi avèk Col-0 SAM (konsantre sou P3, ki gen fwontyè pli menm jan ak P4 nan Ler), byenke nan jenotip sa a pliye ki te fòme nan fwontyè a floral kache selil IPR yo pi vit (figi 7g-i). Kidonk, modèl divizyon selil IPR pre-òganize selil yo nan ranje radial, tankou nan internodes. Òganizasyon ranje radial ak lokalizasyon selil IPR ant ògàn siksesif sijere ke selil sa yo se progenitors internodal.
Isit la, nou devlope yon biosensor siyal GA ratiometric, qmRGA, ki pèmèt kat quantitative nan aktivite siyal GA ki soti nan konsantrasyon konbine GA ak GA reseptè pandan y ap minimize entèferans ak chemen siyal andojèn, kidonk bay enfòmasyon sou fonksyon GA nan nivo selilè. Pou rezon sa a, nou te konstwi yon pwoteyin DELLA modifye, mRGA, ki te pèdi kapasite nan mare patnè entèraksyon DELLA men ki rete sansib nan proteolysis GA-induit. qmRGA reponn a tou de chanjman ekzojèn ak andojèn nan nivo GA, ak pwopriyete deteksyon dinamik li yo pèmèt evalyasyon chanjman espas-temporal nan aktivite siyal GA pandan devlopman. qmRGA se tou yon zouti trè fleksib paske li ka adapte a diferan tisi lè w chanje pwomotè yo itilize pou ekspresyon li (si sa nesesè), epi bay nati konsèvasyon chemen siyal GA ak motif PFYRE atravè anjyospèm, li posib pou l transfere nan lòt espès22. Konfòm ak sa a, yo te montre yon mitasyon ekivalan nan diri SLR1 DELLA pwoteyin (HYY497AAA) tou pou siprime aktivite repressè kwasans SLR1 pandan y ap diminye yon ti kras degradasyon GA-medyatè li yo, menm jan ak mRGA23. Miyò, etid resan yo nan Arabidopsis te montre ke yon sèl mitasyon asid amine nan domèn PFYRE (S474L) chanje aktivite transcription RGA san yo pa afekte kapasite li pou kominike avèk patnè faktè transcription50. Malgre ke mitasyon sa a trè pre sibstitisyon 3 asid amine ki prezan nan mRGA, etid nou yo montre ke de mitasyon sa yo chanje karakteristik diferan nan DELLA. Malgre ke pifò patnè faktè transkripsyon mare nan domèn LHR1 ak SAW nan DELLA26,51, kèk asid amine konsève nan domèn PFYRE ka ede estabilize entèraksyon sa yo.
Devlopman Internode se yon karakteristik kle nan achitekti plant ak amelyorasyon sede. qmRGA devwale pi wo aktivite siyal GA nan selil progenitor internode IPR. Lè nou konbine D' quantitative ak jenetik, nou te montre ke modèl siyal GA sipèpoze sikilè / transverse avyon divizyon selilè nan epidèm SAM a, fòme òganizasyon divizyon selilè ki nesesè pou devlopman internode. Plizyè regilatè nan oryantasyon plan divizyon selilè yo te idantifye pandan devlopman52,53. Travay nou an bay yon egzanp klè sou fason aktivite siyal GA kontwole paramèt selilè sa a. DELLA ka kominike avèk konplèks pwoteyin prepliye41, kidonk siyal GA ka kontwole oryantasyon plan divizyon selilè lè li enfliyanse dirèkteman oryantasyon mikrotubul kortik40,41,54,55. Nou sanzatann te montre ke nan SAM, korelasyon nan pi wo aktivite siyal GA pa t 'elongasyon selilè oswa divizyon, men sèlman anisotropi kwasans, ki se ki konsistan avèk yon efè dirèk nan GA sou direksyon an nan divizyon selilè nan IPR la. Sepandan, nou pa ka eskli ke efè sa a ta ka tou endirèk, pou egzanp medyatè pa ralantisman miray selil GA-induit56. Chanjman nan pwopriyete mi selil yo pwovoke estrès mekanik57,58, ki kapab tou enfliyanse oryantasyon avyon divizyon selilè a lè yo afekte oryantasyon mikrotubul kortik yo39,46,59. Efè konbine GA-pwovoke estrès mekanik ak règleman dirèk nan oryantasyon microtubule pa GA ka patisipe nan jenere yon modèl espesifik nan oryantasyon divizyon selilè nan IPR a defini internodes, ak plis etid yo bezwen teste lide sa a. Menm jan an tou, etid anvan yo te mete aksan sou enpòtans ki genyen nan pwoteyin DELLA ki entèraksyon TCP14 ak 15 nan kontwòl fòmasyon internode60,61 ak faktè sa yo ka medyatè aksyon an nan GA ansanm ak BREVIPEDICELLUS (BP) ak PENNYWISE (PNY), ki kontwole devlopman internode epi yo te montre yo enfliyanse siyal GA2,62. Etandone ke DELLA yo kominike avèk brassinosteroid, etilèn, asid jasmonik, ak asid abscisik (ABA) siyal chemen siyal63,64 e ke òmòn sa yo ka enfliyanse oryantasyon mikrotubule65, efè GA sou oryantasyon divizyon selilè yo ka medyatè tou pa lòt òmòn.
Syans sitolojik bonè te montre ke tou de rejyon enteryè ak ekstèn nan Arabidopsis SAM yo obligatwa pou devlopman internode2,42. Lefèt ke GA aktivman kontwole divizyon selilè nan tisi enteryè yo12 sipòte yon fonksyon doub nan GA nan reglemante gwosè meristem ak internode nan SAM la. Modèl divizyon selilè direksyon an tou sere reglemante nan tisi SAM anndan an, e règleman sa a esansyèl pou kwasans tij52. Li pral enteresan pou egzaminen si GA jwe tou yon wòl nan oryante avyon divizyon selilè nan òganizasyon SAM anndan an, kidonk senkronize spesifikasyon ak devlopman internodes nan SAM la.
Plant yo te grandi nan vitro nan tè oswa 1x Murashige-Skoog (MS) mwayen (Duchefa) complétée ak 1% sikwoz ak 1% agar (Sigma) nan kondisyon estanda (16 h limyè, 22 ° C), eksepte pou ipokotil ak eksperyans kwasans rasin nan ki plant yo te grandi sou plak vètikal anba limyè konstan ° C ak 2222 ° C. Pou eksperyans nitrat, plant yo te grandi sou mwayen MS modifye (medyòm plant bioWORLD) konplete ak nitrat adekwat (0 oswa 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% sikwoz ak 1% A-agar (Sigma) nan kondisyon ki dire lontan.
GID1a cDNA ki te antre nan pDONR221 te rekòmanse ak pDONR P4-P1R-pUBQ10 ak pDONR P2R-P3-mCherry nan pB7m34GW pou jenere pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 ADN ki te antre nan pDONR221 te rekòmanse nan pB7RWG266 pou jenere p35S:IDD2-RFP. Pou jenere pGID1b::2xmTQ2-GID1b, yo te premye anplifye yon fragman 3.9 kb en nan rejyon kodaj GID1b ak yon fragman 4.7 kb ki gen cDNA GID1b (1.3 kb) ak terminator (3.4 kb) yo te premye anplifye lè l sèvi avèk primè yo nan Tablo Siplemantè PDON 3 epi apre PR4. Syantifik) ak pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), respektivman, epi finalman rekonbine ak pDONR221 2xmTQ268 nan vektè sib pGreen 012567 lè l sèvi avèk klonaj Gateway. Pou jenere pCUC2::LSSmOrange, sekans pwomotè CUC2 (3229 bp en nan ATG) ki te swiv pa sekans kodaj gwo Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange)69 ak siyal lokalizasyon nikleyè N7 la ak terminateur transcriptional NOS la te rasanble nan vektè pGreen ki sèvi ak vektè kanamycin rekòmandasyon Gateway3. (Invitrogen). Vektè binè plant la te prezante nan souch Agrobacterium tumefaciens GV3101 epi li te prezante nan fèy Nicotiana benthamiana pa metòd enfiltrasyon Agrobacterium ak nan Arabidopsis thaliana Col-0 pa metòd plonje floral, respektivman. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry ak pCLV3::mCherry-NLS qmRGA yo te izole de pitit F3 ak F1 kwaze respektif yo, respektivman.
RNA in situ hybridization te fèt sou apeprè 1 cm long tire konsèy72, ki te kolekte epi imedyatman fiks nan solisyon FAA (3.7% fòmaldeyid, 5% asid acetic, 50% etanòl) pre-refwadi a 4 °C. Apre 2 × 15 min tretman vakyòm, yo te chanje fiksatif la epi echantiyon yo te enkube lannwit lan. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, ak RGL3 cDNAs ak sond antisans nan 3′-UTR yo te sentèz lè l sèvi avèk primè yo montre nan Tablo Siplemantè 3 jan sa dekri pa Rosier et al.73. Sond ki make digoxigenin yo te iminodetekte lè l sèvi avèk antikò digoxigenin (dilusyon 3000 fwa; Roche, nimewo katalòg: 11 093 274 910), ak seksyon yo te tache ak 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfat (BCIP, 250-tetrazolium)/NBIP. 200-pliye dilution) solisyon.
Tan poste: Feb-10-2025