Mèsi paske w vizite Nature.com.Vèsyon navigatè w ap itilize a gen sipò CSS limite.Pou pi bon rezilta, nou rekòmande pou w itilize yon vèsyon pi nouvo nan navigatè w la (oswa enfim mòd konpatibilite nan Internet Explorer).Antretan, pou asire sipò kontinyèl, nou ap montre sit la san style oswa JavaScript.
Dekouvèt ak itilizasyon benefisye nan pwodwi natirèl ka ede amelyore lavi moun.Pwodui chimik ki anpeche kwasans plant yo lajman itilize kòm èbisid pou kontwole move zèb.Akòz bezwen pou sèvi ak diferan kalite èbisid, gen yon bezwen yo idantifye konpoze ak nouvo mekanis aksyon.Nan etid sa a, nou te dekouvri yon nouvo konpoze N -alkoxypyrrole, koumamonamid, ki soti nan Streptomyces werraensis MK493-CF1 e nou te etabli pwosesis sentèz konplè a.Atravè tès aktivite byolojik, nou te dekouvri ke asid urs-monoamik se yon entèmedyè sentetik nan urs-monoamid ak yon potansyèlinibitè kwasans plant.Anplis de sa, nou te devlope divès kalite dérivés asid urbenonik, ki gen ladan derive urbenyloxy (UDA), ki gen gwo aktivite èbisid san yo pa afekte negatif kwasans selil HeLa.Nou te jwenn tou ke dérivés asid urmotonik deranje mikrotubul plant yo;Anplis de sa, KAND afekte filaman aktin ak pwovoke lanmò selil;Efè sa yo plizyè aspè diferan de sa yo ki nan inibitè mikrotubul li te ye ak sijere yon nouvo mekanis nan aksyon pou asid ursonik, ki reprezante yon avantaj enpòtan nan devlopman nan èbisid nouvo.
Dekouvèt la ak aplikasyon pratik nan pwodwi natirèl benefisye ak dérivés yo se yon mwayen pou amelyore kalite lavi moun.Metabolit segondè ki pwodui pa mikwo-òganis, plant ak ensèk yo te mennen nan gwo pwogrè nan medikaman ak agrikilti.Anpil antibyotik ak dwòg anti-lesemi yo te devlope nan pwodwi natirèl.Anplis de sa, divès kalitepestisid, fonjisid ak èbisid yo ekstrè nan pwodui natirèl sa yo pou itilize nan agrikilti.An patikilye, èbisid kontwòl move zèb yo se zouti enpòtan pou ogmante pwodiksyon rekòt nan agrikilti modèn, ak divès kalite konpoze yo deja itilize komèsyalman.Plizyè pwosesis selilè nan plant yo, tankou fotosentèz, metabolis asid amine, sentèz miray selil, règleman mitoz, siyal fitoormon, oswa sentèz pwoteyin, yo konsidere kòm sib tipik nan èbisid.Konpoze ki anpeche fonksyon mikrotubul yo se yon klas komen nan èbisid ki afekte kwasans plant lè yo afekte règleman mitotik2.
Mikrotubul yo se eleman nan sitoskelèt la epi yo lajman konsève nan selil ekaryotik yo.Tubulin heterodimer la konsiste de α-tubulin ak β-tubulin ki fòme protofilaman lineyè mikrotubule, ak 13 protofilaman ki fòme yon estrikti silendrik.Microtubules jwe plizyè wòl nan selil plant yo, tankou detèmine fòm selil, divizyon selilè, ak transpò intraselilè3,4.Selil plant yo gen mikrotubul anba manbràn plasma entèfaz la, epi sa yo rele mikrotubul kortikal sa yo panse pou kontwole òganizasyon mikrofibril seluloz atravè règleman konplèks seluloz synthase4,5.Mikrotubul kortik nan selil epidèm rasin yo, prezan nan zòn nan elongasyon rapid nan pwent rasin lan, yo sitiye lateralman, ak mikrofibr seluloz swiv mikrotubul sa yo ak limite direksyon an nan ekspansyon selil, kidonk ankouraje elongasyon selil anisotropik.Se poutèt sa, fonksyon mikrotubul gen rapò ak mòfoloji plant yo.Ranplasman asid amine nan jèn ki kode tubulin lakòz skew nan etalaj mikrotubul kortik ak kwasans bò gòch oswa dwa nan Arabidopsis 6,7.Menm jan an tou, mitasyon nan pwoteyin ki asosye ak mikrotubul ki kontwole dinamik mikrotubul yo ka mennen tou nan kwasans rasin defòme8,9,10,11,12,13.Anplis de sa, tretman ak èbisid mikrotubule ki deranje tankou disopiramid, ke yo rele tou pretilaklor, lakòz tou kwasans rasin oblik bò gòch14.Done sa yo endike ke règleman egzak nan fonksyon mikrotubul enpòtan pou detèmine direksyon kwasans plant yo.
Yo te dekouvri plizyè kalite inibitè mikrotubule, e dwòg sa yo te fè yon kontribisyon enpòtan nan rechèch cytoskeletal, osi byen ke nan agrikilti ak medikaman2.An patikilye, oryzalin, konpoze dinitroanilin, disopiramid, konpoze ki gen rapò ak benzamid, ak analogues yo ka anpeche fonksyon mikrotubule yo epi kidonk anpeche kwasans plant yo.Se poutèt sa, yo lajman itilize kòm èbisid.Sepandan, piske mikrotubul yo se yon eleman enpòtan nan selil plant ak bèt, pifò inibitè mikrotubul yo se sitotoksik nan tou de kalite selil yo.Se poutèt sa, malgre itilite yo rekonèt kòm èbisid, yo itilize yon kantite limite nan ajan antimicrotubule pou rezon pratik.
Streptomyces se yon genus nan fanmi Streptomyces, ki gen ladan aerobic, gram-pozitif, bakteri filaman epi li se lajman li te ye pou kapasite li nan pwodwi yon pakèt metabolit segondè.Se poutèt sa, li konsidere kòm youn nan sous ki pi enpòtan nan nouvo pwodwi natirèl byolojik aktif.Nan etid aktyèl la, nou te dekouvri yon nouvo konpoze ki rele coumamonamide, ki te izole nan Streptomyces werraensis MK493-CF1 ak S. werraensis ISP 5486. Sèvi ak analiz espèk ak analiz espektral konplè, estrikti nan koumamonamid te karakterize ak inik N-alkoxypyrrole kilè eskèlèt li yo. te detèmine.sentèz.Asid ursmonik, yon entèmedyè sentetik nan ursmonoamide ak dérivés li yo, yo te jwenn anpeche kwasans lan ak jèminasyon nan plant modèl popilè Arabidopsis thaliana.Nan yon etid relasyon estrikti-aktivite, nou te jwenn ke yon konpoze ak C9 modifye nan asid ursonik, ki rele nonyloxy derive nan asid ursonik (KAND), siyifikativman amelyore efè a inhibition sou kwasans ak jèminasyon.Miyò, inibitè kwasans plant ki fèk dekouvri tou afekte kwasans tabak ak liverwort epi li pa t 'sitotoksik nan bakteri oswa selil HeLa.Anplis, kèk dérivés asid urmotonic pwovoke yon fenotip rasin defòme, sa vle di ke dérivés sa yo dirèkteman oswa endirèkteman afekte mikrotubul yo.Konfòm ak lide sa a, obsèvasyon nou yo nan mikrotubul ki make swa imunohistochimik oswa ak pwoteyin fliyoresan endike ke tretman KAND depolymerizes mikrotubul yo.Anplis de sa, tretman ak dérivés asid kumamotonic deranje mikrofilaman aktin.Se konsa, nou te dekouvri yon nouvo inibitè kwasans plant ki gen mekanis inik nan aksyon enplike destriksyon nan sitoskelèt la.
Souch MK493-CF1 te izole nan tè nan Shinagawa-ku, Tokyo.Souch MK493-CF1 te fòme miselyòm stromal ki byen branche.Yo te detèmine sekans pasyèl nan jèn RNA ribosomal 16S (1422 bp).Souch sa a sanble anpil ak S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipik souch, 99.93%).Dapre rezilta sa a, li te detèmine ke souch sa a te gen rapò ak kalite souch S. werraensis.Se poutèt sa, nou pwovizwaman te rele souch sa a S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T pwodui menm konpoze bioaktif yo tou.Depi te gen ti rechèch bonè nan jwenn pwodwi natirèl nan mikwo-òganis sa a, plis rechèch chimik te fèt.Apre kiltivasyon S. werraensis MK493-CF1 sou mwayen lòj pa fèmantasyon eta solid nan 30 ° C pou 14 jou, mwayen an te ekstrè ak 50% EtOH.Yo te cheche 60 ml echantiyon pou jwenn 59.5 mg ekstrè brit.Ekstrè brit la te sibi faz ranvèse HPLC pou bay N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, yo te rele koumamonamid, 36.0 mg).Kantite total 1 se apeprè 60% ekstrè brit la.Se poutèt sa, nou deside etidye an detay pwopriyete yo nan kumamotoamide 1.
Coumamonamide 1 se yon poud amorph blan ak espektrometri mas rezolisyon segondè (HRESIMS) konfime C6H8N2O2 (Fig. 1).Fragman pirrol C2-ranplase konpoze sa a karakterize pa δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH nan spectre 1H RMN: 4.5 Hz). , H-5) ak δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), ak spectre 13C NMR montre prezans kat atòm kabòn sp2.Prezans yon gwoup amid nan pozisyon C2 te evalye pa korelasyon HMBC soti nan proton C-3 a kabòn amid carbonyl nan δC 161.1.Anplis de sa, 1 H ak 13 C NMR pik nan δH 4.10 (3H, S) ak δC 68.3 endike prezans nan gwoup N-methoxy nan molekil la.Malgre ke pozisyon kòrèk gwoup méthoxy a poko detèmine lè l sèvi avèk analiz espektroskopik tankou espektroskopi diferans amelyore ak nikleyè Overhauser abrevyasyon (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide te vin premye konpoze kandida.
Pou detèmine estrikti ki kòrèk la nan 1, yo te fè yon sentèz total (figi 2a).Tretman 2-aminopyridine 2 ki disponib nan komès ak m-CPBA te lakòz N-oksid 3 ki koresponn lan nan sede quantitative.Apre 2-aminoazidation nan 2, reyaksyon siklokondansasyon ki dekri pa Abramovich te pote soti nan benzèn nan 90 ° C pou jwenn vle 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 an gram.Vitès 60% (de etap).15,16.Methylation ak idroliz nan 4 Lè sa a, te bay 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic asid (ki rele "asid cumotonic", 6) nan bon sede (70%, de etap).Finalman, amidasyon atravè entèmedyè klori asid 6 lè l sèvi avèk amonyak akeuz te bay Kumamoto amid 1 nan 98% sede.Tout done espèk nan sentèz 1 yo te menm jan ak izole 1, kidonk yo te detèmine estrikti nan 1;
Jeneral sentèz ak analiz de aktivite byolojik urbenamid ak asid urbenic.(a) Sentèz total Kumamoto amid.(b) Plant sovaj Arabidopsis Columbia (Col) ki gen sèt jou yo te grandi sou plak Murashige ak Skoog (MS) ki gen koumamonamid 6 oswa koumamonamide 1 nan konsantrasyon ki endike yo.Ba echèl = 1 cm.
Premyèman, nou te evalye aktivite byolojik urbenamid ak entèmedyè li yo pou kapasite yo nan modile kwasans plant yo.Nou te ajoute plizyè konsantrasyon ursmonamide 1 oswa asid ursmonik 6 nan mwayen MS agar ak kiltive Arabidopsis thaliana plant sou mwayen sa a.Esay sa yo te montre ke gwo konsantrasyon (500 μM) nan 6 anpeche kwasans rasin (figi 2b).Apre sa, nou te pwodwi divès kalite dérivés pa ranplase pozisyon N1 nan 6 epi fè etid relasyon estrikti-aktivite sou yo (pwosesis sentèz analòg la dekri nan Enfòmasyon Sipò (SI)).Arabidopsis plantules yo te grandi sou yon mwayen ki gen 50 μM dérivés asid ursonik, ak longè rasin yo te mezire.jan li montre sou foto a.Jan yo montre nan Figi 3a, b, ak S1, asid koumamo gen diferan longè chenn alkoxy lineyè (9, 10, 11, 12, ak 13) oswa gwo chenn alkoxy (15, 16, ak 17) nan pozisyon N1.Dérivés yo te montre siyifikatif anpèchman nan kwasans rasin.Anplis de sa, nou te jwenn ke aplikasyon 200 μM 10, 11, oswa 17 inibit jèminasyon (figi 3c ak S2).
Etid relasyon estrikti-aktivite Kumamoto amid ak konpoze ki gen rapò.(a) Estrikti ak konplo sentèz analòg yo.(b) Kantifikasyon longè rasin plant 7 jou ki grandi sou mwayen MS avèk oswa san dérivés 50 μM koumamonamid.Asteris yo endike diferans enpòtan ak tretman simulation (tès t, p<0.05).n>18. Done yo montre kòm mwayen ± SD.nt vle di "pa teste" paske plis pase 50% grenn yo pa t jèmen.(c) Kantifikasyon pousantaj jèminasyon grenn trete yo enkube pou 7 jou nan mwayen MS avèk oswa san 200 μM koumamonamid ak konpoze ki gen rapò.Asteris yo endike diferans enpòtan ak tretman simulation (tès chi-kare).n = 96.
Enteresan, adisyon nan chenn bò alkyl pi long pase C9 redwi aktivite inhibitory, sijere ke konpoze ki gen rapò ak asid kumamotoic mande pou chenn bò nan yon sèten gwosè montre aktivite byolojik yo.
Paske analiz relasyon estrikti-aktivite te montre ke C9 te modifye nan asid ursonik ak derive nonyloxy nan asid ursonik (ki refere yo kòm KAND 11) te inibitè kwasans plant ki pi efikas, nou te fè yon karakterizasyon pi detaye nan KAND 11. Tretman Arabidopsis. ak 50 μM KAND 11 prèske konplètman anpeche jèminasyon, tandiske pi ba konsantrasyon (40, 30, 20, oswa 10 μM) nan KAND 11 anpeche kwasans rasin nan yon fason ki depann de dòz (figi 4a, b).Pou teste si KAND 11 afekte viabilite rasin meristem, nou te egzamine meristem rasin tache ak yòd propidium (PI) epi mezire gwosè zòn meristem.Gwosè a nan meristem nan plant grandi sou yon mwayen ki gen 25 μM KAND-11 te 151.1 ± 32.5 μm, pandan y ap gwosè a nan meristem nan plant grandi sou yon mwayen kontwòl ki gen DMSO te 264.7 ± 30.8 μm (figi 4c, d). , ki endike ke KAND-11 retabli aktivite selilè.gaye.Meristèm rasin.Konfòm ak sa a, tretman KAND 11 redwi kantite makè divizyon selilè CDKB2; 1p:: CDKB2; 1-GUS siyal nan meristem rasin lan (Fig. 4e) 17 .Rezilta sa yo endike ke KAND 11 inibit kwasans rasin pa diminye aktivite pwopagasyon selil yo.
Analiz efè inhibition dérivés asid urbenonik (dérivés urbenyloxy) sou kwasans.(a) Plant sovaj Col ki gen 7 jou ki grandi sou plak MS ak konsantrasyon ki endike nan KAND 11. Ba echèl = 1 cm.(b) Kantifikasyon longè rasin.Lèt yo endike diferans enpòtan (Tukey HSD tès, p<0.05).n>16. Done yo montre kòm mwayen ± SD.(c) Mikwoskopi konfokal rasin Col sovaj ki tache ak yod propidium ki grandi sou plak MS avèk oswa san 25 μM KAND 11. Parantèz blan yo endike meristem rasin.Ba echèl = 100 µm.(d) Kantifikasyon gwosè meristem rasin (n = 10 a 11).Diferans estatistik yo te detèmine lè l sèvi avèk tès t (p<0.05).Ba yo reprezante gwosè meristem mwayèn.(e) Mikwoskopi diferans entèferans kontras (DIC) nan yon meristem rasin ki gen konstriksyon CDKB2 a;1pro: CDKB2;1-GUS tache ak tache sou plant ki gen 5 jou ki grandi sou plak MS avèk oswa san tès KAND 25 µM.
Fitotoksisite KAND 11 te plis teste lè l sèvi avèk yon lòt plant dikotiledone, tabak (Nicotiana tabacum), ak yon gwo òganis modèl plant tè, liverwort (Marchantia polymorpha).Kòm nan ka Arabidopsis, plant tabak SR-1 grandi sou mwayen ki gen 25 μM KAND 11 pwodui rasin ki pi kout (figi 5a).Anplis de sa, 40 nan 48 grenn jèmen sou plak ki gen 200 μM KAND 11, tandiske tout 48 grenn jèmen sou medya mock-trete, ki endike ke pi gwo konsantrasyon nan KAND te enpòtan (p.<0.05;chi tès -kare) anpeche jèminasyon tabak la.(figi 5b).Anplis de sa, konsantrasyon nan KAND 11 ki anpeche kwasans bakteri nan liverwort te menm jan ak konsantrasyon efikas nan Arabidopsis (Fig. 5c).Rezilta sa yo endike ke KAND 11 ka anpeche kwasans yon varyete plant yo.Lè sa a, nou te envestige posib cytotoxisite de lous monoamide ki gen rapò ak konpoze nan lòt òganis, sètadi selil HeLa imen ak Escherichia coli souch DH5α, kòm reprezantan ki pi wo bèt ak selil bakteri, respektivman.Nan yon seri de tès pwopagasyon selil, nou obsève ke koumamonamid 1, asid koumamonamid 6, ak KAND 11 pa te afekte kwasans selil HeLa oswa E. coli nan konsantrasyon 100 μM (Fig. 5d, e).
Anpèchman kwasans nan KAND 11 nan òganis ki pa Arabidopsis.(a) Yo te grandi plant tabak SR-1 ki gen de semèn nan sou plak MS ki te pozisyone vètikal ki gen 25 μM KAND 11. (b) Yo te grandi plant tabak SR-1 ki te gen de semèn sou pozisyon orizontal. Plak MS ki gen 200 μM KAND 11. (c) Ti boujon Tak-1 liverwort ki gen de semèn ki te grandi sou plak Gamborg B5 ak konsantrasyon ki endike nan KAND 11. Flèch wouj yo endike espò ki sispann grandi nan enkubasyon de semèn. peryòd.(d) Esè pwopagasyon selil HeLa selil yo.Yo te mezire kantite selil solid nan entèval tan fiks lè l sèvi avèk yon twous konte selil 8 (Dojindo).Kòm yon kontwòl, selil HeLa yo te trete ak 5 μg / ml actinomicin D (Lwa D), ki anpeche transkripsyon RNA polymerase ak lakòz lanmò selil.Analiz yo te fèt an triple.(e) E. coli selil pwopagasyon tès.E. coli kwasans te analize pa mezire OD600.Kòm yon kontwòl, selil yo te trete ak 50 μg / ml ampicillin (Amp), ki inibit sentèz mi selil bakteri.Analiz yo te fèt an triple.
Pou dechifre mekanis aksyon cytotoxicity ki te koze pa konpoze ki gen rapò ak uramid, nou te reanalize dérivés asid urbenic ak efè modere inhibition.jan li montre sou foto a.Jan yo montre nan Figi 2b, 6a, plant yo grandi sou plak agar ki gen gwo konsantrasyon (200 μM) nan asid urmotonik 6 pwodui rasin ki pi kout ak bò gòch koube (θ = – 23.7 ± 6.1), tandiske nan plant yo grandi sou mwayen kontwòl la, la. plant pwodui rasin prèske dwat (θ = – 3.8 ± 7.1).Yo konnen kwasans oblik karakteristik sa a ki soti nan malfonksyònman mikrotubul kortik14,18.Konfòm ak konklizyon sa a, dwòg microtubule-destabilizasyon disopyramide ak oryzalin pwovoke rasin menm jan an panche anba kondisyon kwasans nou an (figi 2b, 6a).An menm tan an, nou teste dérivés asid urmotonik ak chwazi plizyè nan yo ki, nan sèten konsantrasyon, pwovoke kwasans rasin oblik.Konpoze 8, 9, ak 15 chanje direksyon kwasans rasin nan 75 μM, 50 μM, ak 40 μM, respektivman, ki endike ke konpoze sa yo ka efektivman destabilize mikrotubul (figi 2b, 6a).Nou te teste tou derive ki pi pisan asid ursolik la, KAND 11, nan yon konsantrasyon pi ba (15 µM) epi nou te jwenn ke aplikasyon KAND 11 anpeche kwasans rasin ak direksyon kwasans rasin lan te inegal, byenke yo te gen tandans fè pant sou bò gòch la ( Figi C3)..Paske pi wo konsantrasyon nan dwòg microtubule-destabilizasyon pafwa anpeche kwasans plant olye ke lakòz baskile rasin, imedyatman nou evalye posibilite pou KAND 11 afekte mikrotubul lè yo obsève mikrotubul kortik nan selil epidèm rasin yo.Immunohistochemistry lè l sèvi avèk antikò anti-β-tubulin nan selil epidèm nan rasin plantules trete ak 25 μM KAND 11 te montre disparisyon nan prèske tout mikrotubul kortik nan selil epidèm nan zòn nan elongasyon (Fig. 6b).Rezilta sa yo endike ke asid kumamotonic ak dérivés li yo aji dirèkteman oswa endirèkteman sou mikrotubul yo deranje yo e ke konpoze sa yo se nouvo inibitè mikrotubul.
Asid Ursonic ak dérivés li yo chanje mikrotubul kortik nan Arabidopsis thaliana.(a) Ang enklinasyon rasin yo mezire an prezans divès kalite dérivés asid urmotonik nan konsantrasyon ki endike yo.Efè de konpoze li te ye pou anpeche mikrotubul yo: disopiramid ak oryzalin yo te analize tou.Ankadreman an montre estanda yo itilize pou mezire ang kwasans rasin lan.Asteris yo endike diferans enpòtan ak tretman simulation (tès t, p<0.05).n>19. Ba echèl = 1 cm.(b) Mikrotubul kortik nan selil epidèm nan zòn elongasyon an.Mikrotubule nan rasin Arabidopsis Col ki te grandi sou plak MS avèk oswa san 25 μM KAND 11 yo te vizyalize pa tach imunohistochimik lè l sèvi avèk antikò prensipal β-tubulin ak Alexa Fluor-konjige antikò segondè.Ba echèl = 10 µm.(c) Estrikti mitotik mikrotubul yo nan meristem rasin lan.Mikrotubul yo te vizyalize lè l sèvi avèk tach imunohistochimik.Yo te konte estrikti mitotik, ki gen ladan zòn pwofaz, spindles, ak phragmoplasts, apati imaj konfokal yo.Flèch yo endike estrikti mikrotubul mitotik.Asteris yo endike diferans enpòtan ak tretman simulation (tès t, p<0.05).n>9. Ba echèl = 50 µm.
Malgre ke Ursa gen kapasite pou deranje fonksyon mikrotubul, mekanis aksyon li yo espere diferan de ajan depolymerize mikrotubul tipik.Pou egzanp, pi wo konsantrasyon nan ajan depolymerizing mikrotubule tankou disopyramide ak oryzalin pwovoke ekspansyon anisotropik nan selil epidèm, tandiske KAND 11 pa fè sa.Anplis de sa, ko-aplikasyon nan KAND 11 ak disopyramide te lakòz yon repons kwasans rasin disopyramide-induit ak KAND 11-pwovoke anpèchman kwasans te obsève (Fig. S4).Nou menm tou nou analize repons ipèrsansib disopyramide 1-1 (phs1-1) mutan nan KAND 11. phs1-1 gen yon mitasyon kinaz kinaz tubulin ki pa canonical epi li pwodui rasin ki pi kout lè yo trete ak disopyramide9,20.phs1-1 plant mutan grandi sou mwayen agar ki gen KAND 11 te gen rasin ki pi kout menm jan ak sa yo grandi sou disopyramid (fig. S5).
Anplis de sa, nou te obsève estrikti mikrotubul mitotik, tankou zòn pwofaz, spindles, ak phragmoplasts, nan rasin meristem plant yo trete ak KAND 11. Konfòm ak obsèvasyon yo pou CDKB2; 1p:: CDKB2; 1-GUS, yon diminisyon enpòtan nan yo te obsève kantite mikrotubul mitotik (figi .6c).
Pou karakterize sitotoksisite KAND 11 nan rezolisyon subselilè, nou trete selil sispansyon BY-2 tabak ak KAND 11 epi nou obsève repons yo.Nou te premye ajoute KAND 11 nan selil BY-2 ki eksprime TagRFP-TUA6, ki gen etikèt fluorescent mikrotubul yo, pou evalye efè KAND 11 sou mikrotubul kortik.Dansite mikrotubule kortik yo te evalye lè l sèvi avèk analiz imaj, ki kantite pousantaj nan piksèl sitoskelèt nan mitan piksèl sitoplasmik.Rezilta tès yo te montre ke apre tretman ak 50 μM oswa 100 μM KAND 11 pou 1 èdtan, dansite a diminye anpil nan 0.94 ± 0.74% oswa 0.23 ± 0.28%, respektivman, pandan y ap dansite selil trete ak DMSO , montan ± 10631 . % (figi 7a).Rezilta sa yo konsistan ak obsèvasyon nan Arabidopsis ke tretman KAND 11 pwovoke depolymerization nan mikrotubul kortik (Fig. 6b).Nou te egzamine tou liy BY-2 ak filaman aktin ki gen GFP-ABD apre tretman ak menm konsantrasyon KAND 11 epi nou te obsève ke tretman KAND 11 te deranje filaman aktin yo.Tretman ak 50 μM oswa 100 μM KAND 11 pou 1 h siyifikativman redwi dansite filaman aktin a 1.20 ± 0.62% oswa 0.61 ± 0.26%, respektivman, tandiske dansite nan selil DMSO-trete yo te 1.69 ± 0.69% (0.69%).7b).Rezilta sa yo diferansye ak efè propyzamid, ki pa afekte filaman aktin, ak latrunculin B, yon depolymerizer aktin ki pa afekte mikrotubul (SI Figi S6).Anplis de sa, tretman ak koumamonamid 1, asid koumamonamid 6, oswa KAND 11 pa te afekte mikrotubul nan selil HeLa (SI Figi S7).Kidonk, yo kwè mekanis aksyon KAND 11 yo diferan de disrupteurs cytoskeleton li te ye.Anplis de sa, obsèvasyon mikwoskopik nou an nan selil BY-2 ki te trete ak KAND 11 te revele aparisyon lanmò selil pandan tretman KAND 11 e li te montre ke pwopòsyon selil ki mouri Evans ble tache pa t ogmante anpil apre 30 min nan tretman KAND 11, tandiske. apre 90 minit nan tretman ak 50 μM oswa 100 μM KAND, kantite selil mouri ogmante a 43.7% oswa 80.1%, respektivman (Fig. 7c).Ansanm, done sa yo endike ke roman asid ursolic derive KAND 11 la se yon inibitè cytoskeletal plant-espesifik ak yon mekanis aksyon ki te deja pa konnen.
KAND afekte mikrotubul kortik, filaman aktin, ak rantabilite selil BY-2 tabak yo.(a) Vizyalizasyon mikrotubul kortik nan selil BY-2 nan prezans TagRFP-TUA6.Selil BY-2 trete ak KAND 11 (50 μM oswa 100 μM) oswa DMSO yo te egzamine pa mikwoskopi konfokal.Dansite mikrotubule kortik yo te kalkile apati mikrograf 25 selil endepandan.Lèt yo endike diferans enpòtan (Tukey HSD tès, p<0.05).Ba echèl = 10 µm.(b) Cortical actin filaman nan selil BY-2 visualized nan prezans GFP-ABD2.Selil BY-2 trete ak KAND 11 (50 μM oswa 100 μM) oswa DMSO yo te egzamine pa mikwoskopi konfokal.Yo te kalkile dansite filaman aktin kortik apati mikrograf 25 selil endepandan.Lèt yo endike diferans enpòtan (Tukey HSD tès, p<0.05).Ba echèl = 10 µm.(c) Obsèvasyon selil BY-2 ki mouri pa tach ble Evans.Selil BY-2 trete ak KAND 11 (50 μM oswa 100 μM) oswa DMSO yo te egzamine pa mikwoskospi byen klere.n=3.Ba echèl = 100 µm.
Dekouvèt ak aplikasyon nouvo pwodwi natirèl te mennen nan pwogrè enpòtan nan divès aspè nan lavi moun, ki gen ladan medikaman ak agrikilti.Yo te fè rechèch istorik pou jwenn konpoze itil nan resous natirèl yo.An patikilye, actinomycetes yo konnen yo dwe itil kòm antibyotik antiparazit pou nematod akòz kapasite yo nan pwodwi divès metabolit segondè tankou avermectin, konpoze an plon nan ivermectin ak bleomicin ak dérivés li yo, ki itilize medsin kòm yon ajan antikanse21,22.Menm jan an tou, yon varyete konpoze èbisid yo te dekouvri nan aktinomycèt, kèk nan yo ki deja itilize komèsyalman1,23.Se poutèt sa, analiz la nan metabolit aktinomisèt yo izole pwodwi natirèl ak aktivite byolojik vle konsidere kòm yon estrateji efikas.Nan etid sa a, nou te dekouvri yon nouvo konpoze, koumamonamid, ki soti nan S. werraensis ak siksè sentèz li.Ursonic asid se yon entèmedyè sentetik nan urbenamid ak dérivés li yo.Li ka lakòz boukle rasin karakteristik, montre aktivite èbisid modere ak fò, ak dirèkteman oswa endirèkteman domaje mikrotubul plant yo.Sepandan, mekanis nan aksyon nan asid urmotonik ka diferan de sa yo ki deja egziste nan inibitè mikrotubule, depi KAND 11 tou deranje filaman aktin ak lakòz lanmò selil, sijere yon mekanis regilasyon pa ki asid urmotonik ak dérivés li yo enfliyanse yon pakèt estrikti sitoskelèt..
Pli lwen karakterizasyon detaye nan asid urbenonik pral ede pi byen konprann mekanis nan aksyon nan asid urbenonik.An patikilye, pwochen objektif la se evalye kapasite asid ursonik pou mare nan mikrotubul redwi pou detèmine si asid ursonik ak dérivés li yo aji dirèkteman sou mikrotubul epi depolymerize yo, oswa si aksyon yo rezilta nan destabilizasyon mikrotubul.Anplis de sa, nan ka kote mikrotubul yo pa yon sib dirèk, idantifye sit la nan aksyon ak sib molekilè nan asid ursonik sou selil plant yo pral ede plis konprann pwopriyete yo nan konpoze ki gen rapò ak fason posib amelyore aktivite èbisid.Egzamen bioaktivite nou an te revele kapasite inik sitotoksik asid ursonik sou kwasans plant tankou Arabidopsis thaliana, tabak ak liverwort, pandan ke ni E. coli ni selil HeLa te afekte.Ti toksisite oswa pa gen okenn toksisite nan selil bèt yo se yon avantaj nan dérivés asid ursonik si yo devlope kòm èbisid pou itilize nan jaden agrikòl ouvè.Vreman vre, depi mikrotubule yo se estrikti komen nan ekaryot, anpèchman selektif yo nan plant yo se yon kondisyon kle pou èbisid.Pou egzanp, propyzamid, yon ajan depolymerizing mikrotubule ki mare dirèkteman nan tubulin epi anpeche polimerizasyon, yo itilize kòm yon èbisid akòz toksisite ki ba li nan selil bèt24.Kontrèman ak disopiramid, benzamid ki gen rapò gen diferan espesifikasyon sib.Anplis mikrotubul plant, RH-4032 oswa benzoxamide tou inibit mikrotubul nan selil bèt oswa oomycetes, respektivman, ak zalilamid yo itilize kòm yon fonjisid akòz fitotoksisite ki ba li yo25,26,27.Lous ki fèk dekouvri ak dérivés li yo montre sitotoksisite selektif kont plant yo, men li se vo anyen ke plis modifikasyon ka chanje espesifik sib yo, potansyèlman bay dérivés adisyonèl pou kontwòl fongis patojèn oswa oomisèt.
Pwopriyete inik nan asid urbenonik ak dérivés li yo itil pou devlopman yo kòm èbisid epi sèvi ak kòm zouti rechèch.Enpòtans ki genyen nan sitoskelèt la nan kontwole fòm selil plant yo lajman rekonèt.Syans pi bonè yo te montre ke plant yo te evolye mekanis konplèks nan òganizasyon kortik mikrotubul pa kontwole dinamik mikrotubul yo byen kontwole mòfogenesis.Yo te idantifye yon gwo kantite molekil ki responsab règleman aktivite mikrotubul yo, e rechèch ki gen rapò toujou ap kontinye 3,4,28.Konpreyansyon nou ye kounye a sou dinamik mikrotubul nan selil plant yo pa eksplike konplètman mekanis òganizasyon kortik mikrotubul yo.Pou egzanp, byenke tou de disopyramid ak oryzalin ka depolymerize mikrotubul, disopyramide lakòz gwo deformation rasin pandan y ap oryzalin gen yon efè relativman modere.Anplis, mitasyon nan tubulin, ki estabilize mikrotubul yo, lakòz tou dextrowotasyon nan rasin, tandiske paclitaxel, ki tou estabilize dinamik mikrotubul, pa fè sa.Se poutèt sa, etidye ak idantifye sib molekilè nan asid ursolic ta dwe bay nouvo apèsi sou règleman an nan mikrotubul kortik plant yo.Menm jan an tou, pwochen konparezon pwodui chimik ki efikas nan ankouraje kwasans defòme, tankou disopiramid, ak pwodwi chimik mwens efikas, tankou oryzalin oswa asid kumamotoric, pral bay endikasyon sou fason kwasans defòme rive.
Nan lòt men an, rearanjman cytoskeletal ki gen rapò ak defans yo se yon lòt posibilite pou eksplike sitotoksisite asid ursonik.Enfeksyon yon patojèn oswa entwodiksyon yon elisitè nan selil plant pafwa lakòz destriksyon sitoskelèt la ak lanmò selil ki vin apre29.Pou egzanp, kriptoksantin ki sòti nan oomisèt yo te rapòte deranje mikrotubul ak filaman aktin anvan lanmò selil tabak, menm jan ak sa ki rive ak tretman KAND30,31.Resanblans ki genyen ant repons defans ak repons selilè pwovoke pa asid ursonik te mennen nou ipotèz ke yo deklanche pwosesis selilè komen, byenke yon efè pi vit ak pi fò nan asid ursonik pase cryptoxanthin se evidan.Sepandan, etid yo montre ke dezòd nan filaman aktin ankouraje lanmò selil espontane, ki pa toujou akonpaye pa dezòd mikrotubule29.Anplis de sa, li rete yo dwe wè si swa patojèn nan oswa elicitor lakòz kwasans rasin defòme, tankou dérivés asid ursonik fè.Kidonk, konesans molekilè ki lye repons defans ak sitoskelèt la se yon pwoblèm atire yo dwe adrese.Lè yo eksplwate prezans nan konpoze ki ba pwa molekilè ki gen rapò ak asid ursonik, osi byen ke yon seri de dérivés ak diferan puisans, yo ka bay opòtinite yo vize mekanis selilè enkoni.
Ansanm, dekouvèt ak aplikasyon nouvo konpoze ki modile dinamik mikrotubul yo pral bay metòd pwisan pou adrese mekanis molekilè konplèks ki kache detèminasyon fòm selil plant yo.Nan kontèks sa a, asid urmotonik konpoze ki fèk devlope, ki afekte mikrotubul ak filaman aktin epi ki pwovoke lanmò selil, ka bay yon opòtinite pou dechifre koneksyon ant kontwòl mikrotubul ak lòt mekanis sa yo.Kidonk, analiz chimik ak byolojik lè l sèvi avèk asid urbenonik pral ede nou konprann mekanis regilasyon molekilè ki kontwole sitoskelèt plant la.
Vaksi S. werraensis MK493-CF1 nan yon flacon Erlenmeyer 500 mL ki gen 110 mL mwayen grenn ki gen 2% (w/v) galaktoz, 2% (w/v) keratin Essence, 1% (w/v) konpozisyon Bacto. .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) mayi extrait (KOGOSTCH co, Ltd., Japon), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 ak 0.2% CaCO3 nan dlo deionized.(pH 7.4 anvan esterilizasyon).Kilti grenn yo te enkube sou yon shaker rotary (180 rpm) nan 27 ° C pou 2 jou.Kiltivasyon pwodiksyon atravè fèmantasyon eta solid.Kilti grenn (7 ml) te transfere nan yon flacon K-1 500 ml ki gen 40 g mwayen pwodiksyon ki gen 15 g lòj bourade (MUSO Co., Ltd., Japon) ak 25 g dlo deyonize (pH pa ajiste. anvan esterilizasyon).).Fèmantasyon te pote soti nan 30 ° C nan fè nwa a pou 14 jou.Materyèl fèmantasyon an te ekstrè ak 40 ml / boutèy EtOH ak santrifuje (1500 g, 4 ° C, 10 min).Sipènatant kilti a (60 ml) te ekstrè ak yon melanj de 10% MeOH/EtOAc.Kouch òganik la te evapore anba presyon redwi pou jwenn yon rezidi (59.5 mg), ki te sibi HPLC ak elisyon gradyan (0-10 minit: 90%) sou yon kolòn faz ranvèse (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID). 10 mm × longè 250 mm) H2O/CH3CN, 10-35 minit: 90% H2O/CH3CN a 70% H2O/CH3CN (gradyan), 35-45 minit: 90% H2O/EtOH, 45-155 minit: 90% H2O /EtOH a 100% EtOH (gradyan (gradyan), 155-200 min: 100% EtOH) nan yon pousantaj koule nan 1.5 ml / min, coumamonamide (1, 36.0 mg) te izole kòm yon poud blan amorphe.
Kumamotoamid (1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ kalkile valè: 141.0659, mezire valè: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.537
Grenn Columbia (Col-0) yo te jwenn nan Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) avèk pèmisyon pou itilize rechèch.Grenn Col-0 yo te pwopaje epi konsève nan kondisyon laboratwa nou yo epi yo te itilize kòm plant Arabidopsis sovaj.Grenn Arabidopsis yo te sifas esterilize ak kiltive nan mwatye fòs Murashige ak Skoog mwayen ki gen 2% sikwoz (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino) asid etansulfonik (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ).) ak 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, nan 23 °C ak limyè konstan.T. Hashimoto (Nara Enstiti Syans ak Teknoloji) te bay grenn mutan phs1-1 la.
Grenn souch SR-1 yo te bay T. Hashimoto (Nara Enstiti Syans ak Teknoloji) epi yo itilize kòm plant tabak sovaj.Grenn tabak yo te esterilize sifas ak tranpe nan dlo esteril pou twa nwit pou ankouraje jèminasyon, Lè sa a, mete yo nan yon solisyon mwatye fòs ki gen 2% sikwoz, 0.05% (w/v) MES, ak 0.8% gellan jansiv (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.ak Skoog mwayen) ak pH 5.7 ak enkubasyon nan 23 ° C anba limyè konstan.
Souch Tak-1 te bay T. Kohchi (Kyoto University) e li te itilize kòm inite eksperimantal estanda pou etid liverwort la.Gemma te jwenn nan plant kiltive esterilize ak Lè sa a, plake sou mwayen Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) ki gen 1% sikwoz ak 0.3% jansiv gellan ak enkubasyon nan 23 ° C anba limyè kontinyèl.
Selil Tabak BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) te bay pa S. Hasezawa (University of Tokyo).BY-2 selil yo te dilye 95-pliye nan modifye Linsmeier ak Skoog mwayen ak konplete chak semèn ak 2,4-dichlorophenoxyacetic asid 32.Te sispansyon selil la melanje sou yon shaker rotary nan 130 rpm nan 27 ° C nan fè nwa a.Lave selil yo ak 10 fwa volim mwayen fre epi repoze yo nan menm mwayen an.BY-2 liy selil transjenik ki estab eksprime makè mikrotubule TagRFP-TUA6 oswa makè filaman aktin GFP-ABD2 anba pwomotè viris mozayik chou 35S yo te pwodwi jan sa dekri33,34,35.Liy selilè sa yo ka konsève ak senkronize lè l sèvi avèk pwosedi ki sanble ak sa yo itilize pou liy selil orijinal BY-2 la.
Selil HeLa yo te kiltive nan mwayen Dulbecco modifye Eagle's (DMEM) (Life Technologies) complétée ak 10% serom fetis bovine, 1.2 U / ml penisilin, ak 1.2 μg / ml streptomycin nan yon enkibatè 37 ° C ak 5% CO2.
Tout eksperyans ki dekri nan maniskri sa a yo te fèt an akò ak règleman ak direktiv biosekirite Japonè yo.
Konpoze yo te fonn nan dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) kòm solisyon stock ak dilye nan MS mwayen pou Arabidopsis ak tabak oswa Gamborg B5 mwayen pou liverwort.Pou tès anpèchman kwasans rasin lan, yo te simen plis pase 10 grenn pou chak plak sou mwayen agar ki gen konpoze ki endike yo oswa DMSO.Grenn yo te enkube nan yon chanm kwasans pou 7 jou.Yo te pran foto plant yo epi yo te mezire longè rasin yo.Pou tès jèminasyon Arabidopsis, yo te simen 48 grenn pou chak plak sou mwayen agar ki gen 200 μM konpoze oswa DMSO.Grenn Arabidopsis yo te grandi nan yon chanm kwasans ak kantite plant jèmen yo te konte 7 jou apre jèminasyon (dag).Pou tès jèminasyon tabak, yo te simen 24 grenn pou chak plak sou mwayen agar ki gen 200 μM KAND oswa DMSO.Grenn tabak yo te grandi nan yon chanm kwasans ak kantite plant jèmen yo te konte apre 14 jou.Pou tès anpèchman kwasans liverwort la, yo te plake 9 anbriyon ki soti nan chak plak sou mwayen agar ki gen konsantrasyon ki endike nan KAND oswa DMSO epi yo te enkube nan yon chanm kwasans pou 14 jou.
Sèvi ak plant ki tache ak 5 mg/ml yodid propidium (PI) pou wè òganizasyon rasin meristem.Siyal PI yo te obsève pa mikwoskòp fluoresans lè l sèvi avèk yon mikwoskòp optik lazè konfokal TCS SPE (Leica Microsystems).
Tach istochimik nan rasin ak β-glucuronidase (GUS) te fèt dapre pwotokòl ki dekri pa Malami ak Benfey36.Seedlings yo te fiks nan 90% asetòn lannwit lan, tache ak 0.5 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic asid nan tanpon GUS pou 1 èdtan epi yo mete yo nan yon solisyon chloraldehyde idrate.(8 g idrat chloral, 2 ml dlo ak 1 ml gliserin) epi yo obsève pa mikwoskòp diferans entèferans kontras lè l sèvi avèk yon mikwoskòp Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Ang rasin yo te mezire sou plant ki gen 7 jou ki grandi sou plak yo mete vètikal.Mezire ang rasin lan soti nan direksyon vektè gravite a jan sa dekri nan etap 6 la.
Yo te obsève aranjman nan mikrotubul kortik jan sa dekri, ak modifikasyon minè nan pwotokòl la 37.Antikò anti-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ak Alexa Fluor 488-konjige anti-sourit IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) yo te itilize kòm antikò prensipal ak segondè nan 1:1000 ak 1:100 dilution, respektivman.Imaj fluoresans yo te akeri lè l sèvi avèk yon mikwoskòp optik lazè konfokal TCS SPE (Leica Microsystems).Jwenn imaj Z-pile epi kreye pwojeksyon entansite maksimòm dapre enstriksyon manifakti a.
Yo te fè tès pwopagasyon selil HeLa lè l sèvi avèk Twous konte selil 8 (Dojindo) dapre enstriksyon manifakti a.
Te kwasans lan nan E. coli DH5α analize pa mezire dansite selil nan kilti lè l sèvi avèk yon espektrofotomètr nan 600 nm (OD600).
Yo te obsève òganizasyon cytoskeletal nan selil transjenik BY-2 lè l sèvi avèk yon mikwoskòp fliyoresan ekipe ak yon aparèy optik konfokal CSU-X1 (Yokogawa) ak yon kamera sCMOS (Zyla, Andor Technology).Dansite cytoskeletal te evalye pa analiz imaj, ki kantite pousantaj nan piksèl cytoskeletal nan mitan piksèl sitoplasmik nan imaj konfokal lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ jan sa dekri38,39.
Pou detekte lanmò selil nan selil BY-2, yo te enkube yon aliquot nan sispansyon selil la ak 0.05% Evans ble pou 10 minit nan tanperati chanm.Selektif Evans ble tach nan selil mouri depann sou extrusion nan lank nan selil solid pa manbràn nan plasma entak40.Selil tache yo te obsève lè l sèvi avèk yon mikwoskòp byen klere (BX53, Olympus).
Selil HeLa yo te grandi nan DMEM konplete ak 10% FBS nan yon enkibatè imidite nan 37 ° C ak 5% CO2.Selil yo te trete ak 100 μM KAND 11, kumamonamic sid 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), oswa 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) pou 6 h nan 37 ° C.Selil yo te fikse ak MetOH pou 10 min ak Lè sa a, ak acetate pou 5 min nan tanperati chanm.Selil fiks yo te enkube ak antikò prensipal β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) dilye nan 0.5% BSA / PBS pou 2 èdtan, lave 3 fwa ak TBST, ak Lè sa a, enkubasyon ak Alexa Fluor antikò kabrit.488 1 èdtan.– Sourit IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) ak 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dilye nan 0.5% BSA/PBS.Apre yo fin lave ak TBST twa fwa, yo te obsève selil tache sou yon mikwoskòp envèse Nikon Eclipse Ti-E.Imaj yo te kaptire ak yon kamera refwadi Hamamatsu ORCA-R2 CCD lè l sèvi avèk lojisyèl MetaMorph (Aparèy Molekilè).
Tan poste: Jun-17-2024