Dekouvèt, karakterizasyon ak amelyorasyon fonksyonèl monoamid ursa kòm nouvo inibitè kwasans plant ki afekte mikrotubil plant yo.

Mèsi paske ou te vizite Nature.com. Vèsyon navigatè w ap itilize a pa sipòte CSS anpil. Pou pi bon rezilta, nou rekòmande pou w itilize yon vèsyon navigatè w ki pi resan (oswa dezaktive Mòd Konpatibilite nan Internet Explorer). Antretan, pou asire sipò kontinyèl, n ap montre sit la san stil oswa JavaScript.
Dekouvèt ak itilizasyon benefik pwodui natirèl yo ka ede amelyore lavi moun. Pwodui chimik ki inibi kwasans plant yo lajman itilize kòm èbisid pou kontwole move zèb. Akòz nesesite pou itilize diferan kalite èbisid, gen yon bezwen pou idantifye konpoze ki gen nouvo mekanis aksyon. Nan etid sa a, nou te dekouvri yon nouvo konpoze N-alkoksipirrol, koumamonamid, ki soti nan Streptomyces werraensis MK493-CF1 epi nou te etabli pwosesis sentèz konplè a. Atravè tès aktivite byolojik, nou te dekouvri ke asid urs-monoamik se yon entèmedyè sentetik nan urs-monoamid epi yon potansyèl...inibitè kwasans plantAnplis de sa, nou te devlope plizyè dérivés asid urbinonik, tankou dérivés urbinoksi (UDA), ki gen yon gwo aktivite èbisid san li pa afekte kwasans selil HeLa yo negatifman. Nou te jwenn tou ke dérivés asid urmotonik yo deranje mikrotubil plant yo; anplis, KAND afekte filaman aktin yo epi li pwovoke lanmò selilè; Efè miltifasèt sa yo diferan de sa yo ki nan inibitè mikrotubil yo ke yo konnen epi yo sijere yon nouvo mekanis aksyon pou asid ursikonik, ki reprezante yon avantaj enpòtan nan devlopman nouvo èbisid.
Dekouvèt ak aplikasyon pratik pwodui natirèl benefik yo ak dérivés yo se yon mwayen pou amelyore kalite lavi moun. Metabolit segondè ki pwodui pa mikwo-òganis, plant ak ensèk yo te mennen nan gwo pwogrè nan medsin ak agrikilti. Yo te devlope anpil antibyotik ak medikaman kont lesemi apati pwodui natirèl. Anplis de sa, divès kalitepestisid, yo ekstrè fonjisid ak èbisid nan pwodui natirèl sa yo pou yo itilize nan agrikilti. An patikilye, èbisid pou kontwole move zèb yo se zouti enpòtan pou ogmante sede rekòt nan agrikilti modèn, epi plizyè kalite konpoze deja itilize nan komès. Plizyè pwosesis selilè nan plant yo, tankou fotosentèz, metabolis asid amine, sentèz miray selilè, règleman mitoz, siyalizasyon fitoòmòn, oswa sentèz pwoteyin, yo konsidere kòm sib tipik èbisid yo. Konpoze ki anpeche fonksyon mikrotubil yo se yon klas komen èbisid ki afekte kwasans plant yo lè yo afekte règleman mitotik2.
Mikwotubil yo se konpozan sitoskelèt la epi yo lajman konsève nan selil ekaryotik yo. Eterodimè tibilin lan konsiste de α-tibulin ak β-tibulin ki fòme protofilaman mikrotubil lineyè, ak 13 protofilaman ki fòme yon estrikti silendrik. Mikrotubil yo jwe plizyè wòl nan selil plant yo, tankou detèmine fòm selil la, divizyon selilè a, ak transpò entraselulè3,4. Selil plant yo gen mikrotubil anba manbràn plasma entèfaz la, epi yo panse sa yo rele mikrotubil kortikal yo kontwole òganizasyon mikrofibril seluloz yo atravè règleman konplèks sentaz seluloz4,5. Mikrotubil kortikal selil epidèm rasin yo, ki prezan nan zòn elongasyon rapid pwent rasin lan, sitiye lateralman, epi mikrofib seluloz yo swiv mikrotubil sa yo epi limite direksyon ekspansyon selilè a, kidonk ankouraje elongasyon selilè anizotropik. Se poutèt sa, fonksyon mikrotubil la gen yon relasyon sere avèk mòfoloji plant lan. Sibstitisyon asid amine nan jèn ki kode pou tibilin lakòz defòmasyon nan etalaj mikrotubil kortikal yo ak kwasans sou bò gòch oswa bò dwat nan Arabidopsis 6,7. Menm jan an tou, mitasyon nan pwoteyin ki asosye ak mikrotubil ki kontwole dinamik mikrotubil yo kapab lakòz tou kwasans rasin ki defòme8,9,10,11,12,13. Anplis de sa, tretman ak èbisid ki deranje mikrotubil tankou disopiramid, ke yo rele tou pretilaklor, lakòz tou kwasans rasin oblik sou bò gòch14. Done sa yo endike ke règleman presi fonksyon mikrotubil la enpòtan pou detèmine direksyon kwasans plant lan.
Yo dekouvri plizyè kalite inibitè mikrotubil, e medikaman sa yo te fè kontribisyon enpòtan nan rechèch sito-eskelèt, osi byen ke nan agrikilti ak medsin2. An patikilye, oryzalin, konpoze dinitroanilin, disopiramid, konpoze ki gen rapò ak benzamid, ak analog yo ka anpeche fonksyon mikrotubil e konsa anpeche kwasans plant yo. Se poutèt sa, yo lajman itilize kòm èbisid. Sepandan, piske mikrotubil yo se yon eleman enpòtan nan selil plant ak bèt, pifò inibitè mikrotubil yo sitotoksik pou tou de kalite selil yo. Se poutèt sa, malgre itilite yo rekonèt kòm èbisid, yo itilize yon kantite limite ajan antimikrotubil pou rezon pratik.
Streptomyces se yon genus nan fanmi Streptomyces, ki gen ladan bakteri aerobik, gram-pozitif, filamante epi li lajman rekonèt pou kapasite li genyen pou pwodui yon pakèt metabolit segondè. Se poutèt sa, li konsidere kòm youn nan sous ki pi enpòtan pou nouvo pwodui natirèl byolojikman aktif. Nan etid aktyèl la, nou te dekouvri yon nouvo konpoze yo rele koumamonamid, ki te izole nan Streptomyces werraensis MK493-CF1 ak S. werraensis ISP 5486. Lè l sèvi avèk analiz espektral ak analiz espektral konplè, nou te karakterize estrikti koumamonamid la epi nou te detèmine skelèt N-alkoksipiròl inik li a. sentèz. Yo te jwenn ke asid ursmonik, yon entèmedyè sentetik nan ursmonoamid ak dérivés li yo, anpeche kwasans ak jèminasyon plant modèl popilè Arabidopsis thaliana a. Nan yon etid relasyon estrikti-aktivite, nou te jwenn ke yon konpoze ak C9 modifye an asid ursonik, yo rele noniloksi dérivés asid ursonik (KAND), amelyore anpil efè inibitwa sou kwasans ak jèminasyon. Li enpòtan pou note ke nouvo inibitè kwasans plant yo te dekouvri a te afekte kwasans tabak ak epatik tou, epi li pa t sitotoksik pou bakteri oswa selil HeLa. Anplis de sa, gen kèk dérivés asid urmotonik ki pwovoke yon fenotip rasin defòme, sa ki vle di ke dérivés sa yo afekte dirèkteman oswa endirèkteman mikrotubil yo. An akò avèk lide sa a, obsèvasyon nou yo sou mikrotubil ki make swa imunoistochimikman oswa ak pwoteyin fliyoresan endike ke tretman KAND depolimerize mikrotubil yo. Anplis de sa, tretman ak dérivés asid kumamotonik te deranje mikrofilaman aktin yo. Kidonk, nou te dekouvri yon nouvo inibitè kwasans plant ki gen mekanis aksyon inik li enplike destriksyon sitoskelèt la.
Yo te izole souch MK493-CF1 nan tè nan Shinagawa-ku, Tokyo. Souch MK493-CF1 te fòme yon miselyòm estwomal byen branche. Yo te detèmine sekans pasyèl jèn ARN ribozomal 16S la (1422 bp). Souch sa a sanble anpil ak S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: souch tipik, 99.93%). Baze sou rezilta sa a, yo te detèmine ke souch sa a te gen yon relasyon sere avèk souch tip S. werraensis la. Se poutèt sa, nou te bay souch sa a yon non pwovizwa: S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T pwodui menm konpoze bioaktif yo tou. Piske pa t gen anpil rechèch byen bonè sou jwenn pwodui natirèl nan mikwo-òganis sa a, yo te fè plis rechèch chimik. Apre kiltivasyon S. werraensis MK493-CF1 sou mwayen lòj pa fèmantasyon solid nan 30°C pandan 14 jou, yo te ekstrè mwayen an ak 50% EtOH. Yo te seche 60 ml echantiyon an pou jwenn 59.5 mg ekstrè brit. Yo te sibi ekstrè brit la nan HPLC faz envès pou bay N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid (1, yo rele koumamonamid, 36.0 mg). Kantite total 1 la se apeprè 60% nan ekstrè brit la. Se poutèt sa, nou te deside etidye an detay pwopriyete kumamotoamid 1 yo.
Koumamonamid 1 se yon poud amorf blan epi espektwometri mas rezolisyon segondè (HRESIMS) konfime C6H8N2O2 (Fig. 1). Fragman piròl C2-ranplase nan konpoze sa a karakterize pa δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH nan spectre 1H NMR: 4.5 Hz, H-5) ak δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), epi spectre 13C NMR la montre prezans kat atòm kabòn sp2. Prezans yon gwoup amid nan pozisyon C2 a te evalye pa korelasyon HMBC soti nan pwoton C-3 a rive nan kabòn kabonil amid la nan δC 161.1. Anplis de sa, pik 1 H ak 13 C NMR nan δH 4.10 (3H, S) ak δC 68.3 endike prezans gwoup N-metoksi nan molekil la. Malgre ke pozisyon kòrèk gwoup metoksi a pa t ko detèmine lè l sèvi avèk analiz spektroskopik tankou spektroskopi diferans amelyore ak abrevyasyon nikleyè Overhauser (NOEDF), N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid te vin premye konpoze kandida a.
Pou detèmine estrikti kòrèk 1 an, yo te fè yon sentèz total (Fig. 2a). Tretman 2-aminopiridin 2 ki disponib nan komès avèk m-CPBA te bay N-oksid korespondan 3 a nan yon sede kantitatif. Apre 2-aminoazidasyon 2 a, yo te fè reyaksyon siklokondansasyon Abramovich dekri a nan benzèn a 90°C pou jwenn 1-idroksi-1H-pirol-2-karbonitril 5 la an gram. Vitès 60% (de etap). 15,16. Metilasyon ak idwoliz 4 la te bay asid 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksilik (yo rele "asid kumotonik", 6) nan yon bon sede (70%, de etap). Finalman, amidasyon atravè entèmedyè klori asid 6 lè l sèvi avèk amonyak akeuz te bay amid Kumamoto 1 nan yon sede 98%. Tout done espektral sentetize 1 an te sanble ak 1 izole a, kidonk yo te detèmine estrikti 1 an;
Sentèz jeneral ak analiz aktivite byolojik ubènamid ak asid ubènik. (a) Sentèz total amid Kumamoto. (b) Plant Arabidopsis Columbia (Col) ki gen sèt jou nan kalite sovaj yo te grandi sou plak Murashige ak Skoog (MS) ki genyen koumamonamid 6 oswa koumamonamid 1 nan konsantrasyon endike yo. Ba echèl = 1 cm.
Premyèman, nou te evalye aktivite byolojik urbenamid ak entèmedyè li yo pou kapasite yo pou modifye kwasans plant yo. Nou te ajoute divès konsantrasyon ursmonamid 1 oswa asid ursonik 6 nan medyòm MS agar epi nou te kiltive plant Arabidopsis thaliana sou medyòm sa a. Tès sa yo te montre ke gwo konsantrasyon (500 μM) nan 6 te inibi kwasans rasin (Fig. 2b). Apre sa, nou te pwodui divès dérivés lè nou te ranplase pozisyon N1 nan 6 epi nou te fè etid relasyon estrikti-aktivite sou yo (pwosesis sentèz analòg la dekri nan Enfòmasyon Sipò (SI)). Plant Arabidopsis yo te kiltive sou yon medyòm ki gen 50 μM dérivés asid ursonik, epi yo te mezire longè rasin lan jan yo montre sou foto a. Jan yo montre nan Figi 3a, b, ak S1, asid koumamo yo gen diferan longè chenn alkoksi lineyè (9, 10, 11, 12, ak 13) oswa gwo chenn alkoksi (15, 16, ak 17) nan pozisyon N1 an. Derivatif yo te montre yon anpèchman siyifikatif nan kwasans rasin yo. Anplis de sa, nou te jwenn ke aplikasyon 200 μM 10, 11, oswa 17 te anpeche jèminasyon (Fig. 3c ak S2).
Etid sou relasyon estrikti-aktivite amid Kumamoto ak konpoze ki gen rapò. (a) Estrikti ak chema sentèz analog yo. (b) Kantifikasyon longè rasin plantules ki gen 7 jou ki grandi sou medyòm MS avèk oswa san 50 μM dérivés koumamonamid. Asterisk yo endike diferans enpòtan ak tretman fo (tès t, p< 0.05).n>18. Done yo prezante kòm mwayèn ± SD. nt vle di "pa teste" paske plis pase 50% nan grenn yo pa t jèmen. (c) Kantifikasyon to jèminasyon grenn trete yo ki te enkube pandan 7 jou nan medyòm MS avèk oswa san 200 μM koumamonamid ak konpoze ki gen rapò. Asterisk yo endike diferans enpòtan ak tretman fo (tès chi-kare). n=96.
Sa ki enteresan, adisyon chenn lateral alkil ki pi long pase C9 te diminye aktivite inibitwa a, sa ki sijere ke konpoze ki gen rapò ak asid kumamotoik bezwen chenn lateral ki gen yon sèten gwosè pou yo montre aktivite byolojik yo.
Piske analiz relasyon estrikti-aktivite a te montre ke C9 te modifye an asid ursonik e dérivés noniloksi asid ursonik la (ki pral rele KAND 11 apre sa) te inibitè kwasans plant ki pi efikas la, nou te fè yon karakterizasyon KAND 11 ki pi detaye. Tretman Arabidopsis ak 50 μM KAND 11 te prèske konplètman anpeche jèminasyon, alòske konsantrasyon ki pi ba (40, 30, 20, oswa 10 μM) nan KAND 11 te inibi kwasans rasin nan yon fason ki depann de dòz (Fig. 4a, b). Pou teste si KAND 11 afekte viabilité meristèm rasin lan, nou te egzamine meristèm rasin ki te kolore ak yodid propidyòm (PI) epi nou te mezire gwosè sifas meristèm lan. Gwosè meristèm plantules ki te grandi sou yon mwayen ki gen 25 μM KAND-11 te 151.1 ± 32.5 μm, alòske gwosè meristèm plantules ki te grandi sou yon mwayen kontwòl ki gen DMSO te 264.7 ± 30.8 μm (Fig. 4c, d), ki endike ke KAND-11 retabli aktivite selilè a. pwopagasyon. Meristèm rasin. An akò avèk sa, tretman KAND 11 la te redwi kantite siyal makè divizyon selilè CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS nan meristèm rasin lan (Fig. 4e) 17. Rezilta sa yo endike ke KAND 11 anpeche kwasans rasin lan lè li diminye aktivite pwopagasyon selilè.
Analiz efè inibitwa dérivés asid urbinonik (dérivés urbinoksi) sou kwasans. (a) Plantules Col sovaj ki gen 7 jou ki grandi sou plak MS ak konsantrasyon KAND 11 ki endike yo. Ba echèl = 1 cm. (b) Kantifikasyon longè rasin. Lèt yo endike diferans enpòtan (tès Tukey HSD, p< 0.05).n>16. Done yo prezante kòm mwayèn ± SD. (c) Mikwoskopi konfokal rasin Col sovaj ki gen koulè propidium yodid ki grandi sou plak MS avèk oswa san 25 μM KAND 11. Parantèz blan yo endike meristèm rasin lan. Ba echèl = 100 µm. (d) Kantifikasyon gwosè meristèm rasin lan (n = 10 a 11). Diferans estatistik yo te detèmine lè l sèvi avèk tès t (p< 0.05). Ba yo reprezante gwosè mwayèn meristèm nan. (e) Mikwoskopi kontras entèferans diferansyèl (DIC) nan yon meristèm rasin ki gen konstriksyon CDKB2 a; 1pro: CDKB2; 1-GUS kolore epi kolore sou plantules ki gen 5 jou ki grandi sou plak MS avèk oswa san tès KAND 25 µM.
Yo te teste fitotoksisite KAND 11 la plis toujou lè l sèvi avèk yon lòt plant dikotiledon, tabak (Nicotiana tabacum), ak yon gwo òganis modèl plant tè, epatik (Marchantia polymorpha). Menm jan ak Arabidopsis, plant tabak SR-1 yo ki te grandi sou yon mwayen ki gen 25 μM KAND 11 te pwodui rasin ki pi kout (Fig. 5a). Anplis de sa, 40 nan 48 grenn yo te jèmen sou plak ki gen 200 μM KAND 11, alòske tout 48 grenn yo te jèmen sou mwayen ki te trete san refleksyon, sa ki endike ke pi gwo konsantrasyon KAND yo te siyifikatif (p< 0.05; tès chi -kare) te anpeche jèminasyon tabak la. (Fig. 5b). Anplis de sa, konsantrasyon KAND 11 ki te anpeche kwasans bakteri nan epatik la te sanble ak konsantrasyon efikas nan Arabidopsis (Fig. 5c). Rezilta sa yo endike ke KAND 11 ka anpeche kwasans yon varyete plant. Apre sa, nou te envestige posib sitotoksisite konpoze ki gen rapò ak monoamid lous nan lòt òganis, sètadi selil HeLa imen ak souch Escherichia coli DH5α, kòm reprezantan selil bèt siperyè ak selil bakteri, respektivman. Nan yon seri tès pwoliferasyon selilè, nou te obsève ke koumamonamid 1, asid koumamonamidik 6, ak KAND 11 pa t afekte kwasans selil HeLa oswa E. coli nan konsantrasyon 100 μM (Fig. 5d,e).
Inibisyon kwasans KAND 11 nan òganis ki pa Arabidopsis. (a) Plant tabak SR-1 tip sovaj ki gen de semèn yo te kiltive sou plak MS pozisyone vètikalman ki gen 25 μM KAND 11. (b) Plant tabak SR-1 tip sovaj ki gen de semèn yo te kiltive sou plak MS pozisyone orizontalman ki gen 200 μM KAND 11. (c) Boujon epatik Tak-1 tip sovaj ki gen de semèn yo te kiltive sou plak Gamborg B5 ak konsantrasyon KAND 11 ki endike yo. Flèch wouj yo endike espò ki te sispann grandi nan peryòd enkubasyon de semèn nan. (d) Tès pwoliferasyon selilè selil HeLa yo. Yo te mezire kantite selil ki ka viv nan entèval tan fiks lè l sèvi avèk yon twous kontaj selil 8 (Dojindo). Kòm yon kontwòl, yo te trete selil HeLa yo ak 5 μg/ml aktinomisin D (Act D), ki inibi transkripsyon ARN polimeraz epi ki lakòz lanmò selilè. Analiz yo te fèt an triplikat. (e) Tès pwoliferasyon selil E. coli. Yo te analize kwasans E. coli a lè yo te mezire OD600. Kòm yon kontwòl, selil yo te trete ak 50 μg/ml anpisilin (Amp), ki inibi sentèz miray selil bakteri yo. Analiz yo te fèt an triplikat.
Pou nou dechifre mekanis aksyon sitotoksisite ki koze pa konpoze ki gen rapò ak uramid, nou te reanalize dérivés asid urbinik ki gen efè inibitwa modere, jan yo montre nan foto a. Jan yo montre nan Figi 2b, 6a, plant ki te grandi sou plak agar ki gen gwo konsantrasyon (200 μM) asid urmotonik 6 te pwodui rasin ki pi kout ak koube agoch ​​(θ = – 23.7 ± 6.1), tandiske plant ki te grandi sou medyòm kontwòl la, plant yo te pwodui rasin prèske dwat (θ = – 3.8 ± 7.1). Kwasans oblik karakteristik sa a li te ye pou li soti nan disfonksyonman mikrotubil kortikal yo14,18. An akò ak rezilta sa a, dwòg ki destabilizan mikrotubil yo, disopiramid ak oryzalin, te pwovoke yon enklinezon rasin menm jan an anba kondisyon kwasans nou yo (Fig. 2b, 6a). An menm tan, nou te teste dérivés asid urmotonik epi nou te chwazi plizyè ladan yo ki, nan sèten konsantrasyon, te pwovoke kwasans rasin oblik. Konpoze 8, 9, ak 15 yo te chanje direksyon kwasans rasin yo a 75 μM, 50 μM, ak 40 μM, respektivman, sa ki endike ke konpoze sa yo ka efektivman destabilize mikrotubil yo (Fig. 2b, 6a). Nou te teste tou derive asid ursolik ki pi puisan an, KAND 11, nan yon konsantrasyon ki pi ba (15 µM) epi nou te jwenn ke aplikasyon KAND 11 te inibi kwasans rasin yo epi ke direksyon kwasans rasin yo te inegal, byenke yo te gen tandans panche agoch ​​(Figi C3). . Piske pi gwo konsantrasyon dwòg ki destabilize mikrotubil yo pafwa inibi kwasans plant yo olye ke yo lakòz rasin yo panche, nou te evalye posiblite ke KAND 11 afekte mikrotubil yo apre sa lè nou te obsève mikrotubil kortikal nan selil epidèm rasin yo. Iminochimi lè l sèvi avèk antikò anti-β-tibulin nan selil epidèm rasin plantules trete ak 25 μM KAND 11 te montre disparisyon prèske tout mikrotubil kortikal nan selil epidèm nan zòn elongasyon an (Fig. 6b). Rezilta sa yo endike ke asid kumamotonik ak dérivés li yo aji dirèkteman oubyen endirèkteman sou mikrotubil yo pou deranje yo epi ke konpoze sa yo se nouvo inibitè mikrotubil.
Asid irosonik ak dérivés li yo modifye mikrotubil kortikal nan Arabidopsis thaliana. (a) Ang enklinasyon rasin mezire an prezans divès dérivés asid irostonik nan konsantrasyon endike yo. Yo te analize tou efè de konpoze ke yo konnen ki inibi mikrotubil yo: disopiramid ak oryzalin. Ankadreman an montre estanda ki itilize pou mezire ang kwasans rasin lan. Asterisk yo endike diferans enpòtan ak tretman fo (tès t, p< 0.05).n>19. Ba echèl = 1 cm. (b) Mikrotubil kortikal nan selil epidèm nan zòn elongasyon an. Mikrotubil nan rasin Arabidopsis Col tip sovaj ki grandi sou plak MS avèk oswa san 25 μM KAND 11 yo te vizyalize pa kolorasyon imunoistochimik lè l sèvi avèk antikò prensipal β-tibulin ak antikò segondè Alexa Fluor-konjige. Ba echèl = 10 µm. (c) Estrikti mitotik mikrotubil nan meristèm rasin lan. Mikrotubil yo te vizyalize lè l sèvi avèk kolorasyon imunoistochimik. Estrikti mitotik, ki gen ladan zòn pwofaz, fizèl, ak fragmoplast, yo te konte nan imaj konfokal yo. Flèch yo endike estrikti mikrotubil mitotik yo. Asterisk yo endike diferans enpòtan ak tretman fo (tès t, p< 0.05).n>9. Ba echèl = 50 µm.
Malgre Ursa gen kapasite pou deranje fonksyon mikrotubil yo, mekanis aksyon li espere diferan de ajan depolymerizasyon mikrotubil tipik yo. Pa egzanp, pi gwo konsantrasyon ajan depolymerizasyon mikrotubil tankou disopiramid ak oryzalin pwovoke ekspansyon anizotropik selil epidèm yo, alòske KAND 11 pa fè sa. Anplis de sa, ko-aplikasyon KAND 11 ak disopiramid te lakòz yon repons kwasans rasin konbine pwovoke pa disopiramid epi yo te obsève inibisyon kwasans pwovoke pa KAND 11 (Fig. S4). Nou te analize tou repons mutant disopiramid 1-1 ipèrsansib (phs1-1) a KAND 11. phs1-1 gen yon mitasyon pwen kinaz tubulin ki pa kanonik epi li pwodui rasin ki pi kout lè yo trete l ak disopiramid9,20. Plantules mutant phs1-1 ki te grandi sou mwayen agar ki gen KAND 11 te gen rasin ki pi kout menm jan ak sa yo ki te grandi sou disopiramid (fig. S5).
Anplis de sa, nou te obsève estrikti mikrotubil mitotik, tankou zòn pwofaz, fizèl, ak fragmoplast, nan meristèm rasin plantules trete ak KAND 11. An akò ak obsèvasyon yo pou CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, nou te obsève yon diminisyon siyifikatif nan kantite mikrotubil mitotik (Fig. .6c).
Pou nou karakterize sitotoksisite KAND 11 nan rezolisyon subselilè, nou te trete selil sispansyon tabak BY-2 yo ak KAND 11 epi nou te obsève repons yo. Nou te premye ajoute KAND 11 nan selil BY-2 ki eksprime TagRFP-TUA6, ki make mikrotubil yo avèk fliyoresans, pou evalye efè KAND 11 sou mikrotubil kortikal yo. Dansite mikrotubil kortikal la te evalye lè l sèvi avèk analiz imaj, ki te quantifye pousantaj pixel sitoskelèt pami pixel sitoplasmik yo. Rezilta tès yo te montre ke apre tretman ak 50 μM oswa 100 μM KAND 11 pandan 1 èdtan, dansite a te diminye anpil a 0.94 ± 0.74% oswa 0.23 ± 0.28%, respektivman, pandan ke dansite selil trete yo ak DMSO te rive nan 1.61 ± 0.34% (Fig. 7a). Rezilta sa yo konsistan avèk obsèvasyon nan Arabidopsis ke tretman KAND 11 pwovoke depolimerizasyon mikrotubil kortikal yo (Fig. 6b). Nou te egzamine liy BY-2 la tou avèk filaman aktin ki make ak GFP-ABD apre tretman avèk menm konsantrasyon KAND 11 la epi nou te obsève ke tretman KAND 11 la te deranje filaman aktin yo. Tretman avèk 50 μM oswa 100 μM KAND 11 pandan 1 èdtan te siyifikativman redwi dansite filaman aktin nan 1.20 ± 0.62% oswa 0.61 ± 0.26%, respektivman, tandiske dansite nan selil trete ak DMSO te 1.69 ± 0.51% (Fig. 2). 7b). Rezilta sa yo kontraste ak efè propyzamide, ki pa afekte filaman aktin yo, ak latrunculin B, yon depolimerizatè aktin ki pa afekte mikrotubil yo (Figi SI S6). Anplis de sa, tretman avèk koumamonamid 1, asid koumamonamid 6, oswa KAND 11 pa t afekte mikrotubil nan selil HeLa yo (Figi SI S7). Kidonk, yo kwè mekanis aksyon KAND 11 la diferan de sa ki nan perturbateur sitoskelèt yo ke yo konnen deja. Anplis de sa, obsèvasyon mikwoskopik nou te fè sou selil BY-2 trete ak KAND 11 yo te revele aparisyon lanmò selilè pandan tretman KAND 11 la epi li te montre ke pwopòsyon selil mouri ki te gen koulè ble Evans yo pa t ogmante anpil apre 30 minit tretman KAND 11, tandiske apre 90 minit tretman ak 50 μM oswa 100 μM KAND, kantite selil mouri yo te ogmante a 43.7% oswa 80.1%, respektivman (Fig. 7c). Lè nou mete tout ansanm, done sa yo endike ke nouvo derive asid ursolik KAND 11 la se yon inibitè sitoskelèt espesifik pou plant ki gen yon mekanis aksyon nou pa t konnen anvan.
KAND afekte mikrotubil kortikal yo, filaman aktin yo, ak viabilité selil BY-2 tabak yo. (a) Vizyalizasyon mikrotubil kortikal nan selil BY-2 an prezans TagRFP-TUA6. Selil BY-2 trete ak KAND 11 (50 μM oswa 100 μM) oswa DMSO yo te egzamine pa mikwoskopi konfokal. Dansite mikrotubil kortikal la te kalkile apati mikwograf 25 selil endepandan. Lèt yo endike diferans enpòtan (tès Tukey HSD, p< 0.05). Ba echèl = 10 µm. (b) Filaman aktin kortikal nan selil BY-2 yo te vizyalize an prezans GFP-ABD2. Selil BY-2 trete ak KAND 11 (50 μM oswa 100 μM) oswa DMSO yo te egzamine pa mikwoskòp konfokal. Dansite filaman aktin kortikal yo te kalkile apati mikwografi 25 selil endepandan. Lèt yo endike diferans enpòtan (tès Tukey HSD, p< 0.05). Ba echèl = 10 µm. (c) Obsèvasyon selil BY-2 mouri yo pa koloran ble Evans. Selil BY-2 trete ak KAND 11 (50 μM oswa 100 μM) oswa DMSO yo te egzamine pa mikwoskopi chan klere. n=3. Ba echèl = 100 µm.
Dekouvèt ak aplikasyon nouvo pwodui natirèl yo te mennen nan pwogrè siyifikatif nan divès aspè nan lavi moun, tankou medikaman ak agrikilti. Yo te fè rechèch istorik pou jwenn konpoze itil nan resous natirèl yo. An patikilye, aktinomizèt yo konnen kòm itil kòm antibyotik antiparazit pou nematod akòz kapasite yo pou pwodui divès metabolit segondè tankou avermectin, konpoze prensipal ivermectin ak bleomisin ak dérivés li yo, yo itilize medsinalman kòm yon ajan antikanser21,22. Menm jan an tou, yo te dekouvri yon varyete konpoze èbisid nan aktinomizèt, kèk ladan yo deja itilize komèsyalman1,23. Se poutèt sa, analiz metabolit aktinomizèt pou izole pwodui natirèl ki gen aktivite byolojik vle yo konsidere kòm yon estrateji efikas. Nan etid sa a, nou te dekouvri yon nouvo konpoze, koumamonamid, ki soti nan S. werraensis epi nou te sentetize li avèk siksè. Asid irosonik se yon entèmedyè sentetik nan urbenamid ak dérivés li yo. Li ka lakòz yon boukle rasin karakteristik, montre yon aktivite èbisid modere pou rive fò, epi domaje dirèkteman oswa endirèkteman mikrotubil plant yo. Sepandan, mekanis aksyon asid urmotonik la ka diferan de sa ki nan inibitè mikrotubil ki deja egziste yo, piske KAND 11 deranje filaman aktin yo tou epi li lakòz lanmò selilè, sa ki sijere yon mekanis regilasyon kote asid urmotonik ak dérivés li yo enfliyanse yon pakèt estrikti sito-eskelèt.
Yon karakterizasyon pi detaye sou asid urbinonik la ap ede pi byen konprann mekanis aksyon asid urbinonik la. An patikilye, pwochen objektif la se evalye kapasite asid ursikon pou lye ak mikrotubil redwi pou detèmine si asid ursikon ak dérivés li yo aji dirèkteman sou mikrotubil yo epi depolimerize yo, oswa si aksyon yo lakòz destabilizasyon mikrotubil yo. Anplis de sa, nan ka kote mikrotubil yo pa yon sib dirèk, idantifye sit aksyon an ak sib molekilè asid ursikon sou selil plant yo ap ede pi byen konprann pwopriyete konpoze ki gen rapò yo ak fason posib pou amelyore aktivite èbisid la. Tès byoaktivite nou an te revele kapasite sitotoksik inik asid ursikon sou kwasans plant tankou Arabidopsis thaliana, tabak ak epatik, alòske ni selil E. coli ni selil HeLa pa t afekte. Ti kras oswa pa gen toksisite pou selil bèt yo se yon avantaj dérivés asid ursikon si yo devlope kòm èbisid pou itilize nan jaden agrikòl ouvè. Anfèt, piske mikrotubil yo se estrikti komen nan eukaryot yo, inibisyon selektif yo nan plant yo se yon egzijans kle pou èbisid yo. Pa egzanp, yo itilize pwopilamid, yon ajan depolimerizasyon mikrotubil ki lye dirèkteman ak tibilin epi ki anpeche polimerizasyon, kòm èbisid akòz toksisite ki ba pou selil bèt yo24. Kontrèman ak disopiramid, benzamid ki gen rapò ak li yo gen diferan espesifikite sib. Anplis mikrotubil plant yo, RH-4032 oswa benzoksamid anpeche tou mikrotubil selil bèt yo oswa oomisèt yo, respektivman, epi yo itilize zalilamid kòm yon fonjisid akòz fitotoksisite ki ba li25,26,27. Lous ki fèk dekouvri a ak dérivés li yo montre sitotoksisite selektif kont plant yo, men li enpòtan pou note ke plis modifikasyon ka chanje espesifikite sib yo, potansyèlman bay plis dérivés pou kontwòl chanpiyon patojèn oswa oomisèt.
Pwopriyete inik asid urbinonik la ak dérivés li yo itil pou devlopman yo kòm èbisid ak itilizasyon kòm zouti rechèch. Enpòtans sitoskelèt la nan kontwole fòm selil plant yo lajman rekonèt. Etid anvan yo te montre ke plant yo te devlope mekanis konplèks òganizasyon mikrotubil kortikal yo lè yo kontwole dinamik mikrotubil yo pou byen kontwole mòfojènèz. Yo te idantifye yon gwo kantite molekil ki responsab regilasyon aktivite mikrotubil yo, epi rechèch ki gen rapò ak sa a toujou ap kontinye3,4,28. Konpreyansyon nou genyen kounye a sou dinamik mikrotubil nan selil plant yo pa eksplike nèt mekanis òganizasyon mikrotubil kortikal yo. Pa egzanp, byenke tou de disopiramid ak oryzalin ka depolimerize mikrotubil yo, disopiramid lakòz yon gwo deformation nan rasin yo pandan ke oryzalin gen yon efè relativman modere. Anplis de sa, mitasyon nan tibilin, ki estabilize mikrotubil yo, lakòz tou dekstrowotasyon nan rasin yo, tandiske paklitaksèl, ki estabilize tou dinamik mikrotubil yo, pa fè sa. Se poutèt sa, etidye ak idantifye sib molekilè asid ursolik yo ta dwe bay nouvo enfòmasyon sou regilasyon mikrotubil kortikal plant yo. Menm jan an tou, konparezon nan lavni ant pwodui chimik ki efikas nan ankouraje kwasans defòme, tankou disopiramid, ak pwodui chimik ki mwens efikas, tankou oryzalin oswa asid kumamotorik, pral bay endikasyon sou kijan kwasans defòme rive.
Yon lòt bò, rearanjman sito-eskelèt ki gen rapò ak defans yo se yon lòt posibilite pou eksplike sitotoksisite asid ursonik la. Enfeksyon yon patojèn oswa entwodiksyon yon elisè nan selil plant yo pafwa lakòz destriksyon sito-eskelèt la ak lanmò selilè ki vin apre a29. Pa egzanp, yo rapòte ke kriptoksantin ki sòti nan oomisèt deranje mikrotubil ak filaman aktin anvan lanmò selil tabak la, menm jan ak sa ki rive ak tretman KAND30,31. Resanblans ki genyen ant repons defans ak repons selilè ki pwovoke pa asid ursonik te fè nou ipotèz ke yo deklanche pwosesis selilè komen, byenke yon efè asid ursonik ki pi rapid ak pi fò pase kriptoksantin evidan. Sepandan, etid yo montre ke dezòd filaman aktin yo ankouraje lanmò selilè espontane, ki pa toujou akonpaye pa dezòd mikrotubil29. Anplis de sa, li rete pou wè si swa patojèn nan oswa elisè a lakòz kwasans rasin defòme, jan dérivés asid ursonik yo fè. Kidonk, konesans molekilè ki lye repons defans yo ak sito-eskelèt la se yon pwoblèm atiran pou adrese. Lè yo eksplwate prezans konpoze ki gen ti pwa molekilè ki gen rapò ak asid ursonik, ansanm ak yon seri dérivés ki gen divès puisans, yo ka bay opòtinite pou vize mekanis selilè enkoni.
Lè nou mete tout ansanm, dekouvèt ak aplikasyon nouvo konpoze ki modifye dinamik mikrotubil yo pral bay metòd pwisan pou adrese mekanis molekilè konplèks ki dèyè detèminasyon fòm selil plant yo. Nan kontèks sa a, konpoze asid urmotonik ki fèk devlope a, ki afekte mikrotubil ak filaman aktin epi ki pwovoke lanmò selilè, ka bay yon opòtinite pou dechifre koneksyon ki genyen ant kontwòl mikrotubil ak lòt mekanis sa yo. Kidonk, analiz chimik ak byolojik lè l sèvi avèk asid urbinonik pral ede nou konprann mekanis regilasyon molekilè ki kontwole sitoskelèt plant lan.
Enokile S. werraensis MK493-CF1 nan yon flakon Erlenmeyer 500 mL ki gen ladan l 110 mL medyòm pou grenn ki gen 2% (w/v) galaktoz, 2% (w/v) pat esans, 1% (w/v) konpozisyon Bacto-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) ekstrè mayi (KOGOSTCH Co., Ltd., Japon), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 ak 0.2% CaCO3 nan dlo deyonize. (pH 7.4 anvan esterilizasyon). Kilti grenn yo te enkube sou yon shaker rotary (180 rpm) a 27°C pandan 2 jou. Kiltivasyon pwodiksyon atravè fèmantasyon nan eta solid. Yo te transfere kilti grenn yo (7 ml) nan yon flakon K-1 500 ml ki gen 40 g medyòm pwodiksyon ki gen ladan 15 g lòj prese (MUSO Co., Ltd., Japon) ak 25 g dlo deyonize (pH pa ajiste anvan esterilizasyon). Yo te fè fèmantasyon an a 30°C nan fènwa pandan 14 jou. Yo te ekstrè materyèl fèmantasyon an ak 40 ml/boutèy EtOH epi yo te santrifije l (1500 g, 4°C, 10 min). Yo te ekstrè sipènatant kilti a (60 ml) ak yon melanj 10% MeOH/EtOAc. Kouch òganik la te evapore anba presyon redwi pou jwenn yon rezidi (59.5 mg), ki te sibi HPLC ak elisyon gradyan (0–10 minit: 90%) sou yon kolòn faz envès (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × longè 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minit: 90% H2O/CH3CN a 70% H2O/CH3CN (gradyan), 35–45 minit: 90% H2O/EtOH, 45–155 minit: 90% H2O/EtOH a 100% EtOH (gradyan (gradyan), 155–200 min: 100% EtOH) nan yon vitès koule 1.5 ml/min, koumamonamid (1, 36.0 mg) te izole kòm yon poud amorf blan.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valè kalkile: 141.0659, valè mezire: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Grenn Columbia (Col-0) yo te jwenn nan Sant Resous Byolojik Arabidopsis (ABRC) avèk pèmisyon pou itilizasyon nan rechèch. Grenn Col-0 yo te miltipliye epi konsève nan kondisyon laboratwa nou yo epi yo te itilize kòm plant Arabidopsis sovaj. Grenn Arabidopsis yo te esterilize sou sifas epi kiltive nan yon mwayen Murashige ak Skoog mwatye fòs ki gen 2% sikwoz (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) asid 2-(4-morfolino)etansulfonik (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) ak 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, a 23 °C ak limyè konstan. Grenn mutant phs1-1 yo te bay pa T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Grenn souch SR-1 yo te bay pa T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) epi yo te itilize kòm plant tabak sovaj. Grenn tabak yo te esterilize an sifas epi tranpe nan dlo esteril pandan twa nwit pou ankouraje jèminasyon, answit mete yo nan yon solisyon mwatye fòs ki gen 2% sikwoz, 0.05% (w/v) MES, ak 0.8% gom jelan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. ak Skoog medium) ak pH 5.7 epi enkube a 23°C anba limyè konstan.
T. Kohchi (Inivèsite Kyoto) te bay souch Tak-1 la epi li te itilize kòm inite eksperimantal estanda pou etid sou epatik la. Yo te jwenn Gemma nan plant kiltive esterilize epi answit yo te plante l sou medyòm Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) ki gen 1% sikwoz ak 0.3% gom jelan epi yo te enkube l a 23°C anba limyè kontinyèl.
Selil BY-2 tabak yo (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) te founi pa S. Hasezawa (Inivèsite Tokyo). Selil BY-2 yo te delye 95 fwa nan yon medyòm Linsmeier ak Skoog modifye epi yo te ajoute chak semèn asid 2,4-diklorofenoksiasetik 32. Sispansyon selilè a te melanje sou yon ajitatè rotary a 130 rpm a 27°C nan fènwa. Lave selil yo ak 10 fwa volim medyòm fre a epi resispann yo nan menm medyòm nan. Liy selil transjenik BY-2 ki eksprime makè mikrotubil TagRFP-TUA6 la oswa makè filaman aktin GFP-ABD2 la anba pwomotè viris mozayik chou-fleur 35S la te pwodui jan yo te dekri33,34,35. Liy selilè sa yo ka konsève epi senkronize lè l sèvi avèk pwosedi ki sanble ak sa yo ki te itilize pou liy selilè BY-2 orijinal la.
Selil HeLa yo te kiltive nan medyòm Dulbecco modifye Eagle (DMEM) (Life Technologies) complété ak 10% seròm fetal bovin, 1.2 U/ml penisilin, ak 1.2 μg/ml streptomisin nan yon enkibatè 37°C ak 5% CO2.
Tout eksperyans ki dekri nan maniskri sa a te fèt an akò avèk règleman ak direktiv biosekirite Japonè yo.
Konpoze yo te fonn nan dimetil silfoksid (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) kòm solisyon stock epi yo te delye yo nan medyòm MS pou Arabidopsis ak tabak oswa medyòm Gamborg B5 pou epatik. Pou tès inibisyon kwasans rasin lan, plis pase 10 grenn pa plak te simen sou medyòm agar ki gen konpoze endike yo oswa DMSO. Grenn yo te enkube nan yon chanm kwasans pandan 7 jou. Yo te foto plantules yo epi yo te mezire longè rasin yo. Pou tès jèminasyon Arabidopsis, 48 ​​grenn pa plak te simen sou medyòm agar ki gen 200 μM konpoze oswa DMSO. Grenn Arabidopsis yo te kiltive nan yon chanm kwasans epi yo te konte kantite plantules ki te jèmen 7 jou apre jèminasyon (dag). Pou tès jèminasyon tabak, 24 grenn pa plak te simen sou medyòm agar ki gen 200 μM KAND oswa DMSO. Grenn tabak yo te kiltive nan yon chanm kwasans epi yo te konte kantite plantules ki te jèmen apre 14 jou. Pou tès inibisyon kwasans epatik la, 9 anbriyon nan chak plak te plante sou yon mwayen agar ki gen konsantrasyon KAND oswa DMSO endike yo epi yo te enkube yo nan yon chanm kwasans pandan 14 jou.
Sèvi ak plant ki te gen koulè 5 mg/ml iyodid propidyòm (PI) pou wè òganizasyon meristèm rasin yo. Yo te obsève siyal PI yo pa mikwoskòp fliyoresans avèk yon mikwoskòp lazè konfokal TCS SPE (Leica Microsystems).
Yo te fè kolorasyon istochimik rasin yo ak β-glukuronidaz (GUS) dapre pwotokòl Malami ak Benfey36 dekri a. Yo te fikse plantules yo nan 90% asetòn pandan tout lannwit lan, yo te kolore yo ak 0.5 mg/ml asid 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-d-glukuronik nan yon tanpon GUS pandan 1 èdtan epi yo te mete yo nan yon solisyon kloralaldeyid idrate (8 g idrat kloral, 2 ml dlo ak 1 ml gliseròl) epi yo te obsève yo pa mikwoskòp kontras entèferans diferansyèl lè l sèvi avèk yon mikwoskòp Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Yo te mezire ang rasin yo sou plantules ki gen 7 jou ki te grandi sou plak ki te plase vètikalman. Mezire ang rasin lan parapò ak direksyon vektè gravite a jan sa dekri nan etap 6 la.
Yo te obsève aranjman mikrotubil kortikal yo jan yo te dekri a, avèk ti modifikasyon nan pwotokòl la 37. Yo te itilize antikò anti-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ak IgG anti-souris konjige ak Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) kòm antikò prensipal ak segondè nan dilisyon 1:1000 ak 1:100, respektivman. Yo te pran imaj fliyoresans yo lè l sèvi avèk yon mikwoskòp eskanè lazè konfokal TCS SPE (Leica Microsystems). Pran imaj Z-stack yo epi kreye pwojeksyon entansite maksimòm dapre enstriksyon manifakti a.
Yo te fè tès pwoliferasyon selil HeLa a lè l sèvi avèk Kit Konte Selil 8 (Dojindo) dapre enstriksyon manifakti a.
Yo te analize kwasans E. coli DH5α a lè yo te mezire dansite selilè nan kilti a avèk yon espektrofotomèt a 600 nm (OD600).
Yo te obsève òganizasyon sito-eskelèt nan selil transjenik BY-2 yo lè l sèvi avèk yon mikwoskòp fliyoresans ekipe ak yon aparèy eskanè konfokal CSU-X1 (Yokogawa) ak yon kamera sCMOS (Zyla, Andor Technology). Yo te evalye dansite sito-eskelèt la pa analiz imaj, ki te quantifye pousantaj piksèl sito-eskelèt pami piksèl sitoplasmik nan imaj konfokal yo lè l sèvi avèk lojisyèl ImageJ jan yo dekri38,39.
Pou detekte lanmò selilè nan selil BY-2 yo, yo te enkube yon alikòt nan sispansyon selilè a avèk 0.05% ble Evans pandan 10 minit nan tanperati chanm. Kolorasyon ble Evans selektif nan selil mouri yo depann de èkstruzyon lank lan soti nan selil ki ka viv pa manbràn plasma entak la40. Selil ki te kolore yo te obsève lè l sèvi avèk yon mikwoskòp chan klere (BX53, Olympus).
Selil HeLa yo te grandi nan DMEM complété ak 10% FBS nan yon enkibatè imidifye a 37°C ak 5% CO2. Selil yo te trete ak 100 μM KAND 11, asid kumamonamik 6, kumamonamid 1, 100 ng/ml kolsemid (Gibco), oswa 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) pandan 6 èdtan a 37°C. Selil yo te fikse ak MetOH pandan 10 minit epi answit ak asetat pandan 5 minit nan tanperati chanm. Selil fiks yo te enkube ak antikò prensipal β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) dilye nan 0.5% BSA/PBS pandan 2 èdtan, lave 3 fwa ak TBST, epi answit enkube ak antikò kabrit Alexa Fluor. 488 1 èdtan. – IgG sourit (Thermo Fisher Scientific: A11001) ak 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dilye nan 0.5% BSA/PBS. Apre yo fin lave selil yo ak TBST twa fwa, yo obsève yo sou yon mikwoskòp envèse Nikon Eclipse Ti-E. Yo te pran imaj yo ak yon kamera CCD Hamamatsu ORCA-R2 ki refwadi lè l sèvi avèk lojisyèl MetaMorph (Molecular Devices).